【摘 要】
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目的:抗生素滥用造成了全球性的细菌耐药危机,导致没有药物可以用来对抗细菌。金属材料作为新型抗菌制品开始被大量应用。整合子可以捕获和切除基因盒,是细菌对药物产生耐药性的一个重要原因。本研究主要探究铜离子和银离子对1类整合子捕获耐药基因盒的影响及其相关机制。方法:在大肠埃希菌中构建一个1类整合子捕获耐药基因盒的体内模型。利用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quanti
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目的:抗生素滥用造成了全球性的细菌耐药危机,导致没有药物可以用来对抗细菌。金属材料作为新型抗菌制品开始被大量应用。整合子可以捕获和切除基因盒,是细菌对药物产生耐药性的一个重要原因。本研究主要探究铜离子和银离子对1类整合子捕获耐药基因盒的影响及其相关机制。方法:在大肠埃希菌中构建一个1类整合子捕获耐药基因盒的体内模型。利用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,q PCR)测定不同浓度银离子(0.3,0.9和1.5μg/m L的Ag+)和铜离子(5,50,100,150和210μg/m L的Cu2+)干预后实验组大肠埃希菌和无金属离子干预对照组大肠埃希菌整合子整合频率,并通过表型筛选法验证。利用质谱法测量细菌吸收的金属离子浓度。并进一步通过转录组测序方法分析银离子抑制细菌整合子捕获耐药基因盒的分子机制。结果:1.qPCR结果表明0.9μg/m L Ag+组整合频率为9.42×10-5(7.91×10-5),1.5μg/m L Ag+组整合频率为7.29×10-5(4.58×10-5)与对照组2.59×10-4(1.09×10-4)相比整合频率明显降低,差异有统计学意义(P<0.001);0.9μg/m L Ag+和1.5μg/m L Ag+组之间没有统计学差异(P>0.05)。对照组与不同浓度铜离子组的整合频率均没有统计学差异(P>0.05),不同浓度铜离子组之间也没有统计学差异(P>0.05)。2.表型筛选法结果为0.9μg/m L Ag+组和1.5μg/m L Ag+组在链霉素的LB平板上菌落数很少,整合频率降低;对照组、0.3μg/m L Ag+组和不同浓度铜离子组在链霉素的LB平板上菌落数均较多,整合频率没有明显变化。表型筛选法与q PCR结果一致;3.电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测发现,随着细菌暴露在银和铜离子浓度增加大肠埃希菌吸收的银和铜离子含量也增多;4.转录组测序比较银离子作用前后大肠埃希菌基因表达的变化,1.5μg/m L Ag+组与对照组相比显著差异基因有241个,其中有139个基因表达上调,下调表达基因102个;5.通过GO功能和KEGG通路富集发现差异表达基因与甲基半乳糖苷转运(methylgalactoside transport)、麦芽糖转运(maltose transport)、磷酸烯图醇式丙酮酸-甘油磷酸转移酶活性(phosphoenolpyruvate-glycerone phosphotransferase activity)和甘油激酶活性(glycerone kinase activity)等功能有关以及涉及氨基酸糖和核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、鞭毛组装(Flagellar assembly)、阳离子抗菌肽(CAMP)耐药性(Cationicantimicrobial peptide(CAMP)resistance)、ABC转运(ABC transporters)、果糖和甘露糖代谢和磷酸糖转移酶系统(Phosphotransferase system(PTS))等代谢通路。6.通过蛋白互作网络筛选出前12个枢纽基因(pts G、mal E、lam B、lac Z、mal K、bas R、ais、ugd、nag E、met N、mal Q和mal F)。结论:金属银离子在达到一定浓度时,能够抑制细菌整合子捕获耐药基因盒。铜离子对整合频率影响不明显,因此不是所有具有杀菌性的金属离子都能对整合频率产生影响。银离子抑制细菌整合子捕获耐药基因盒可能是通过影响麦芽糖转运和碳分解代谢来调控。然而,碳分解代谢和麦芽糖转运过程很复杂,需要进一步分析。目前尚无细菌整合子转录组学相关研究,这为探究整合子捕获基因盒的机制提供了一个新的研究方向。
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