论文部分内容阅读
目光紫外线照射可引起急性损伤如日晒伤和慢性累积性损伤如皮肤癌及光老化。造成生物损害的紫外线主要是波长短，能量较高的UVB(290-320nm)。研究表明一些特别的信号分子调节这个转化反应，包括表皮细胞生长因子受体(EGFR)，AP1，NFkB，PI3激酶，和MAP激酶。这些受体活化和信号分子在光老化和皮肤癌基因表达变化中起着重要的作用。缺氧诱导因子(HIF1 a)是HIF转录复合体成员之一。HIF1 a近来被认为是改变不同类型癌症基因表达模式的一个因素，并且被认为是癌症治疗的一个有效的治疗靶目标。在人类前列腺癌中通过EGFR／PI3K／AKT途径调控HIF1 a表达。然而在紫外线诱导HIF1 a表达中这个途迳是否参与仍不清楚。除了HIF外，其它两个转录因子DEC1和DEC2，近来被认为与HIF相互作用，参与细胞的增殖与存活。最近研究表明紫外线诱导HIF1 a表达需要DEC1，并且DEC1的超表达给细胞提供了缺氧条件下不寻常的存活机制。在这个实验设计中假设EGFR和PI3K／AKT调节紫外线诱导的HIF1 a和它的基因表达。在紫外线照射过程中DEC1和HIF1 a相互调节。研究目的：1、研究UVB辐射诱导皮肤HaCaT细胞HIF1α及其目的基因VEGF、TFR表达a：不同剂量的UVB照射HaCaT细胞，在照射后不同的时间点收集细胞和上清，检测HIF1α及其目的基因VEGF、TFR表达。2、研究EGFR在UV诱导HaCaT细胞HIF1 a及其目的基因VEGF、TFR表达中的作用a：加入EGFR抑制剂，观察HIF1 a及其目的基因VEGF、TFR表达是否会受到抑制b：改变EGFR的表达(EGFR超表达、敲除EGFR基因)，观察EGFR是否调节HIF1 a及其目的基因VEGF、TFR的表达。3、研究在UVB诱导HaCaT细胞HIF1 a及其目的基因VEGF、TFR表达过程中，是否经过PI3K／AKT途径。a：加入PI3K激酶抑制因子观察HIF1 a及其目的基因VEGF、TFR表达是否受到抑制。4、研究在UVB辐射过程中DEC1是否调节HIF1α及其目的基因VEGF、TFR表达。a：改变DEC1的表达(DEC1超表达、敲除基因)，观察UVB辐射诱导HIF1 a及其目的基因VEGF、TFR的表达过程中是否受DEC1调节。5、研究HIF1α对其目的基因VEGF、TFR的调节作用a：改变HIF1α的表达(小RNA干扰)，观察UVB辐射诱导VEGF、TFR的表达过程中是否受HIF1 a调节。研究方法：1．Western免疫印迹法检测HIF1 a。2．流式细胞仪检测EGFR、磷酸化EGFR和TFR的表达。3．ELISA检测上清中VEGF的水平。4．realtime-PCR检测HIF1 a、VEGF及TFR mRNA表达。5．利用Lentivectors慢病毒系统建立了针对HIF1α基因HaCaT(RNAi)稳转细胞株。研究结果：1、不同剂量的UVB(0、10、20、30mJ／cm~2)辐射HaCaT细胞，在照射后6小时、12小时和24小时收集细胞检测HIF1 a及其目的基因VEGF、TFR蛋白表达，与未照射组相比，可发现紫外线可促进HIF1 a及其目的基因VEGF、TFR蛋白表达，并呈剂量和时间依赖性。(P均＜0.05)。不同剂量的UVB(0、10、20、30mJ／cm~2)辐射HaCaT细胞，照射后4小时收集细胞，30mJ／cm~2UVB辐射HaCaT细胞，在照射后1小时、2小时、4小时、8小时和16小时收集细胞，提取RNA，realtime-PCR检测HIF1 a、VEGF及TFR mRNA表达，结果发现，与未照射组相比，UVB不改变HIF1 a mRNA(P均＞0.05)，10mJ／cm~2就能明显改变VEGF和TFRmRNA的表达(P＜0.05)，随着辐射剂量的加大，VEGF和TFRmRNA的表达量增加。VEGF mRNA在照射后4小时达高峰，TFRmRNA在照射后8小时达高峰。2、30mJ／cm~2UVB照射HaCaT，在照射后0、15min、30min、1h、2h、4h、8h收集细胞，流式细胞仪检测EGFR和磷酸化EGFR的表达。结果发现紫外线照射后15min可以检测到磷酸化EGFR的表达，30min时达最高峰，2h至8h降至基础水平。在整个过程中EGFR的表达量不变。30mJ／cm~2UVB照射(EGFR+／-)、(EGFR+／+)和(EGFR-／-)MEF，照射后6、12、24h收集细胞及上清，检测HIF1α、TFR及VEGF的表达水平。HaCaT细胞在照射前1小时加不同浓度的EGFR抑制因子PD153035，照射后24小时收细胞及上清，检测HIF1α、TFR及VEGF表达水平。结果发现(EGFR+＼+)MEF细胞组HIF1α，VEGF表达明显高于MEF(EGFR+／-)和(EGFR-／-)MEF细胞组(P均＜0.05)，(EGFR-／-)MEF细胞组UVB对HIF1α、VEGF分泌促进作用不明显(P均＞0.05)。PD153035，可明显抑制HIF1α、TFR及VEGF表达，1um有抑制作用(P均＜0.05)，5um抑制作用增强。3、30mJ／cm~2紫外线照射HaCaT，PI3K抑制因子LY294002 0um、5um、20um，wortmanin 0nm、500nm在照射前1小时不同的浓度加入，照射后12h收集细胞和上清。与未加抑制剂组相比，LY294002在5um有抑制作用(P均＜0.05)、20um抑制作用更强。wortmanin 500nm对HIF1α、TFR及VEGF表达也有着较强的抑制作用(P均＜0.05)。4、30mJ／cm~2UVB照射(DEC1+／-)、(DEC1+／+)和(DEC1-／-)HaCaT，照射后6、12、24h收集细胞及上清，检测HIF1α、TFR及VEGF的蛋白表达水平，结果发现，(DEC1+＼+)HaCaT细胞组HIF1α，VEGF表达明显高于(DEC1+／-)HaCaT和(DEC1-／-)HaCaT细胞组(P均＜0.05)，(DEC1-／-)HaCaT细胞组UVB对HIF1α、VEGF促进作用明显低于(DEC1+／-)HaCaT组(P均＜0.05)。30mJ／cm~2UVB辐射(DEC1+／-)、(DEC1+／+)和(DEC1-／-)HaCaT细胞，在照射后1小时、2小时、4小时、8小时和16小时收集细胞，提取RNA，realtime-PCR检测HIF1 a、VEGF及TFR mRNA表达。结果发现与(DEC1+／-)HaCaT组相比，(DEC1+＼+)HaCaT组VEGF mRNA在照射后16小时达高峰，且表达量增高。(DEC1-／-)HaCaT细胞组随时间的改变，VEGF mRNA表达变化不明显(P＞0.05)，表达量均低于(DEC1+／-)HaCaT组(P均＜0.05)。与(DEC1+／-)HaCaT组相比，(DEC1+＼+)HaCaT组TFR mRNA高峰时间没有改变，但表达量明显增高(P均＜0.05)(DEC1-／-)HaCaT细胞组，TFRmRNA表达量均低于(DEC1+／-)HaCaT组(P均＜0.05)5、30mJ／cm~2UVB照射(SiRNAHIF1α)稳定HaCaT细胞组和正常HaCaT细胞组，24小时收集细胞和上清检测TFR和VEGF的蛋白表达。结果发现，与正常HaCaT细胞组比，(SiRNAHIF1α)稳定HaCaT细胞组TFR和VEGF的蛋白表达量明显降低(P均＜0.05)。结论：UVB可以时间和剂量依赖的方式诱导HIF1 a及其目的基因VEGF、TFR的表达，且是通过EGFR／PI3K／AKT／DEC1信号途径诱导，并且HIF1α也调控其目的基因VEGF、TFR的表达。