MiR-196a通过调节上皮—间质转化促进人结直肠癌细胞转移

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背景越来越多的证据表明,microRNA(miRNA)在肿瘤转移中通过调节上皮-间质转化(EMT)过程发挥了关键作用。我们通过qRT-PCR检测时发现miR-196a在人类结直肠癌(CRC)细胞和结直肠癌组织中呈高表达。wound healing和cell migration assays实验表明miR-196a促进结直肠癌细胞转移,而miR-196a-in呈现相反的效果。与EMT相关的E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-钙粘蛋白(α-catenin)和波形蛋白(vimentin)采用qRT-PCR和Western-Blots分析发现miR-196a上调波形蛋白的表达并下调E-cadherin和α-catenin表达。总之,miR-196a通过调节EMT促进了结直肠癌细胞的转移。研究目的通过利用qRT-PCR方法来检测结直肠癌细胞株、结直肠癌组织及癌旁组织中miR-196a的表达情况,选择适当的结直肠癌细胞株进行质粒转染并设置对照实验组,进一步通过qRT-PCR、woundhealing、cell migration方法证实miR-196a在结直肠癌细胞中呈高表达并能促进结直肠癌细胞转移。利用qRT-PCR和Western-blots实验分别观察EMT相关的E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-粘蛋白(α-catenin)和波形蛋白(vimentin)表达情况,分析miR-196a是否调节了EMT过程。研究方法1.通过qRT-PCR技术检测八对结直肠癌及癌旁组织,以及3种结直肠癌细胞株(HT-29、SW620、SW480)的miR-196a表达情况,根据检测结果选择相应结直肠癌细胞株进行细胞培养。2.将已经选择的结直肠癌细胞株进行质粒转染(miR-196a-in、miR-196a)及相应的阴性对照组(NC)和(NC-in),共计4组并继续培养。3.Wound healing细胞划痕实验,观察4组细胞迁移移动距离,在显微镜下进行拍摄,利用Pro Plus 6图像软件进行分析。4.Migration assays迁移分析,采用Transwell膜进行迁移实验,观察染色细胞在显微镜下活动并计数。5.Western-blots免疫印迹实验,用β-actin(β肌动蛋白)作为内参检测E-cadherin、vimentin及α-catenin情况并进行分析。统计分析所有统计的数据均以平均±标准差(SD)表示,利用SPSS 17软件进行统计处理。P值小于0.05被认为有显著差异。研究结果1.我们采用了qRT-PCR技术对8组结直肠癌组织(T)及癌旁组织(ANT)中的miR-196a表达量进行检测发现:结直肠癌组织及癌旁组织中miR-196a表达差异性明(P<0.05),T/ANT大于1。检测结直肠癌细胞系中(HT-29、SW620和SW480)通过qRT-PCR分析,结果表明:SW620结直肠癌细胞株中miR-196a表达量与HT-29细胞株接近,明显高于SW480细胞株,而且相比之下SW620细胞株容易获的,鉴于上述结果,就决定用SW620继续行细胞实验。2.MiR-196a能促进结直肠癌细胞转移,将结直肠癌SW620细胞转染miR-196a和miR-196a-in并与(NC)和(NC-in)组进行对照。Wound healing实验证明SW620细胞转染miR-196a后迁移距离最远,与对照组相比差异性明显(P<0.05),与此相反的是SW620细胞株转染miR-196a-in后迁移距离最短,与对照组相比差异性明显(P<0.05)。此外,Migration assays实验结果显示,转染miR-196a后SW620细胞迁移能力明显提高,而miR-196a-in降低了细胞的迁移距离,在统计学上差异性明显(P<0.05)。总之,这些实验结果表明:miR-196a过度表达会促进结直肠癌细胞的转移。3.MiR-196a上调vimentin的表达并且下调E-cadherin和α-carenin表达,我们确定了其机制的基础为miR-196a通过调控EMT的相关的E-cadherin、vimentin和α-catenin实现的。RT-PCR显示:miR-196a作用下vimentin中相应的MRNA表达最高,E-cadherin和α-carenin明显减少(P<0.05),Western blot结果显示,miR-196a在减少E-cadherin和α-carenin表达同时而增加vimentin表达,miR-196a-in则与之相反。结论1.MiR-196a在结直肠癌组织和结直肠癌细胞中呈高表达。2.MiR-196a能促进结直肠癌细胞转移。3.MiR-196a通过调节上皮-间质转化(EMT)促进结直肠癌细胞转移。
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