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实验目的采用地塞米松诱导的肝胰岛素抵抗细胞模型、脂肪细胞胰岛素抵抗模型和肌细胞胰岛素抵抗模型,研究树豆酮酸A(缩写CAA)调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗的作用,并探讨其可能的作用机制。实验方法采用CCK8法检测不同浓度的CAA对3T3-L1小鼠前脂肪细胞增殖的影响；诱导3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化,油红0染色法检测不同浓度的CAA对细胞成脂分化的影响；实时荧光定量PCR和Western-blot法在mRNA和蛋白质水平追踪细胞分化过程中蛋白酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)的表达情况。3T3-L1小鼠前脂肪细胞、C2C12小鼠成肌细胞分别诱导分化为成熟的脂肪细胞和肌细胞,采用地塞米松(DEX)诱导人肝细胞HepG2以及分化成熟的3T3-L1、C2C12细胞建立胰岛素抵抗细胞模型,不同浓度CAA作用于各细胞模型,葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD法)检测细胞葡萄糖消耗量；实时荧光定量PCR和Western-blot法检测PTP1B基因及蛋白表达水平；Western-blot法检测胰岛素信号传导通路中相关蛋白(IRS-1、IRS-2、IRβ、PI3K、 AKT、GLUT1、GLUT4、GSK-3β)表达及磷酸化(p-IRβ、p-AKT)水平。实验结果1. PTP1B在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中的表达：实时荧光定量PCR结果显示,3T3-L1前脂肪细胞于细胞融合1天后,PTP1B mRNA水平逐渐增加,分化诱导剂Ⅰ加入2天出现峰值；随后PTP1B mRNA水平呈下降趋势,诱导分化液换成正常培养基后,随着细胞呈现明显的成脂样分化(胞质出现脂滴),PTP1B mRNA水平再次上升。Western-blot结果显示,PTP1B蛋白水平变化趋势同mRNA,但出现滞后。2.CAA对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响：CAA在18.75-200μ mol/L浓度范围内对3T3-L1前脂肪细胞增殖无显著影响(P>0.05),但抑制其向脂肪细胞的分化以及脂肪的合成,且随剂量增加而增强。在150和200μ mol/L浓度抑制作用显著(P<0.01),抑制率达到78.72%和87.25%。3.CAA对胰岛素抵抗脂肪细胞的作用：CAA (25μmol/L)对正常细胞葡萄糖消耗无显著影响(P>0.05),但明显促进地塞米松诱导的胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗(P<0.05)。与正常细胞比较,胰岛素抵抗脂肪细胞PTP1B mRNA水平没有显著性差异,但蛋白水平明显增加(P<0.01), PTP1B蛋白表达增加42.6%；CAA (25μmol/L)可显著降低胰岛素抵抗脂肪细胞PTP1B mRNA及蛋白表达水平(P<0.01),对PTP1B mRNA及蛋白表达抑制率分别为为24.8%和72.5%。与正常细胞比较,胰岛素抵抗脂肪细胞胰岛素信号传导通路中的相关蛋白IRS-1、IRS-2、IRβ、p-IRβ、PI3K表达水平明显下降(P<0.01),对GSK-3β表达则明显增加(P<0.01),其中,IRβ下降了44.38%,p-IRβ下降了32.61%,IRS-1下降了96.15%,IRS-2下降了90.34%,PI3K下降了40.74%,GSK-3β增加了35.17%；CAA可上调胰岛素抵抗脂肪细胞IRS-1、IRS-2、IRβ、p-IRβ及PI3K的表达(P<0.01),但对GSK-3β表达水平无显著影响(P>0.05),其中,IR β增加了26.99%,p-IRβ增加了67.19%,IRS-1增加了60.03%,IRS-2增加了180.67%,PI3K增加了40.74%。4.CAA对胰岛素抵抗肝细胞的作用：CAA (40μmol/L)对正常细胞葡萄糖消耗无显著影响(P>0.05),但明显促进地塞米松诱导的胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗(P<0.05)。与正常细胞比较,胰岛素抵抗肝细胞PTP1B mRNA和蛋白水平均显著增加(P<0.01) PTP1B mRNA及蛋白表达分别上调了165.96%和39.11%;CAA (40μmol/L)可显著降低胰岛素抵抗肝细胞PTP1B mRNA及蛋白表达水平(P<0.01),对PTP1B mRNA及蛋白表达抑制率分别为为41.60%和57.72%。与正常细胞比较,胰岛素抵抗肝细胞胰岛素信号传导通路中的相关蛋白AKT、GLUT1表达水平明显下降(P<0.05或P<0.01),IRβ总蛋白水平没有明显变化,其磷酸化水平稍有下降,但与正常细胞比较无显著性差异,IRS-2及GSK-3β表达水平也无明显变化；CAA可上调胰岛素抵抗肝细胞IRS-2、AKT、GLUT1表达及IRβ磷酸化水平(P<0.01),下调GSK-3β表达(P<0.05),其中,IRS-2表达增加了24.85%,GLUT1表达增加了55.87%,AKT表达增加了41.52%,AKT磷酸化水平提高了43.50%,IR β磷酸化水平提高了41.75%;GSK-3β表达下降了16.5%。5.CAA对胰岛素抵抗肌细胞的作用：CAA (10μmol/L)对正常细胞葡萄糖消耗无显著影响(P>0.05),但明显促进地塞米松诱导的胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗(P<0.05)。与正常细胞比较,胰岛素抵抗肌细胞PTP1B mRNA和蛋白水平均显著增加(P<0.01) PTP1B mRNA及蛋白表达分别上调了51.64%和29.03%；CAA (10μmol/L)可显著降低胰岛素抵抗肌细胞PTP1B mRNA及蛋白表达水平(P<0.01),对PTP1B mRNA及蛋白表达抑制率分别为为43.54%和35.96%。与正常细胞比较,胰岛素抵抗肌细胞胰岛素信号传导通路中的相关蛋白IRS-1、GLUT4表达水平明显下降(P<0.01),IRβ表达异常增高(P>0.05),AKT总蛋白水平没有明显变化,但其磷酸化水平显著下降(P<0.01), GSK-3β表达水平增加(P<0.05)；CAA可上调胰岛素抵抗肌细胞IRS-1、GLUT4表达及I Rβ、AKT磷酸化水平(P<0.01),下调GSK-3β表达(P<0.05),其中,IRS-1表达提高21.06%,GLUT4表达提高36.97%,IRβ提高21.06%,p-IRβ提高25.29%,AKT磷酸化水平提高119.67%,GSK-3β下降了19%。结论CAA对3T3-L1、HepG2、C2C12细胞无明显毒性。对3T3-L1前脂肪细胞增殖无显著影响,但可抑制其成脂分化。地塞米松诱导的胰岛素抵抗脂肪细胞、肝细胞和肌细胞,其PTP1B水平均提高,提示胰岛素抵抗可能与PTP1B密切相关。CAA可促进各胰岛素抵抗细胞对葡萄糖的消耗,其作用机制可能与下调PTP1B表达,进而影响胰岛素信号传导通路相关蛋白表达有关。