论文部分内容阅读
筛选高活性纤维素酶生产菌,构建新型高效的纤维素降解工程菌被认为是目前针对能源消耗、油价上涨、环境污染等一系列问题最有效的解决途径之一。本研究结合刚果红染色和酶活检测的方法筛选得到一株可高效降解纤维素的菌株,形态学观察、分类地位鉴定及核糖体-ITS序列分析结果表明,此菌株为长枝木霉,命名为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)CD-6,于中国普通微生物菌种中心保存,保藏编号为CGMCC No.5395。CMCase、FPA酶、木聚糖酶活检测,最高酶活性分别为50.65IU/ml105.09IU/ml、172.62IU/ml,结果表明该菌株不仅生长速度快且能在短时间内产生大量高活性纤维素酶,对不同天然纤维素底物均具有较高的降解能力。克隆了三种纤维素酶基因,分别为长枝木霉的外切葡聚糖酶基因cbhⅡ,里氏木霉的内切葡聚糖酶基因egⅢ和黑曲霉的p-葡萄糖苷酶基因bgl,并对基因序列进行同源性分析。构建真核表面展示载体pYE-cbh、pYD-eg-bgl,转化入酿酒酵母感受态细胞中构建表面展示纤维素酶的重组酿酒酵母菌株。对表达不同纤维素酶基因的重组酵母所产的纤维素酶进行活性检测及酶学性质分析。重组菌株CEN-pYD-EG-BGL、CEN-pYED-CBH-EG-BGL内切葡聚糖酶活性检测,最大值分别为304.68IU/ml、426.79IU/ml。重组菌株CEN-pYE-CBH、CEN-pYD-EG-BGL、 CEN-pYED-CBH-EG-BGL的滤纸酶活性检测,最大值分别为322.27IU/ml、293.86IU/ml、294.69IU/ml。重组菌株CEN-pYED-CBH-EG-BGL所产重组酶的酶学性质分析表明,最适pH、最适反应温度分别为5.0和50℃。稳定性分析结果显示,在pH4.0-10.0、温度20℃-50℃范围内均具有良好的稳定性。利用重组酿酒酵母菌株CEN-pYE+pYD(对照)、CEN-pYE-CBH、CEN-pYD-EG-BGL、 CEN-pYED-CBH-EG-BGL降解利用微晶纤维素,结果显示除对照菌株外均具有纤维素降解能力,菌株CEN-pYED-CBH-EG-BGL降解能力最强。重组菌株CEN-pYED-CBH-EG-BGL利用微晶纤维素厌氧发酵生产乙醇,乙醇最高浓度为2.63g/L,乙醇产量为0.3g/g(每消耗1克微晶纤维素所产乙醇质量)。以上结果表明,本研究所构建的表面展示三种纤维素酶的酿酒酵母菌株可以有效的直接利用微晶纤维素同步糖化发酵生产乙醇。