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目的： 1．制备高纯度、高比活的rhIL-6蛋白，并建立一系列的纯化流程。 2．确定ss-PEG修饰rhIL-6蛋白的反应条件，探讨修饰前后rhIL-6蛋白促血小板增殖作用及半衰期的变化。 方法： 1．应用发酵技术制备rhIL-6蛋白。 2．采用SDS-PAGE，SP-FF强阳离子交换柱层析，size exclusion HPLC，electrospray mass spectrometry，Western blot以及N-末端氨基酸序列测定来完成rhIL-6的纯化和氨基酸序列检测。 3．应用ss-PEG修饰rhIL-6蛋白，采用SDS-PAGE和LKB凝胶扫描仪测定ss-PEG-rhlL-6的分子量、修饰率和修饰度。用SephadexG-75进行凝胶过滤柱层析来纯化和分离修饰产物。采用MTT法检测rhIL-6的生物学活性。 4．将rhIL-6和ss-PEG-rhIL-6每天给Balb/C小鼠皮下注射持续7天，每天尾静脉取血，通过计数血小板来观察rhIL-6和ss-PEG-rhIL-6促血小板增殖作用。将两种药物进行125I标记，Wistar大鼠皮下注射后，于不同时间点尾静脉取血，检测放射活性，了解半衰期变化。 结果： 1．建立了接种量、接种时间、pH、溶氧等发酵条件。在30L的发酵罐里，最佳条件为接种0.2％，溶氧≥50％，pH为6.5，rhIL-6的最大 重组人白细胞介素乃的中试研制 摘要 表达量为 40％，纯度为 98．5％，比活达 SX 10’U加g。 2．建立了纯化流程，确定rhIL－6的氨基酸序列与已知序列相同。 3．确定了ss－PEG 与rhIL－6 的最适摩尔比为40：1，修饰产物 ss－PEG－rhIL－6的分子量56KD，占总蛋白的百分率为45％，赖氨酸 的修饰度为50％，生物学活性保持55％。 4．rhIL—6对血小板增殖的作用以一种剂量依赖的方式增加，第6到7 天血小板水平达到最大值。ss－PEG－rhIL－6剂量为 2 u g／天，显著高 于 rh1L－6（20 u g／天）的促血小板增殖作用。rhIL－6很快在几分钟 内被从循环中清除，而同等剂量的ss－PEG－rhIL－6在血液中持续可 达40小时。 结论： 1．制备高纯度、高比活的rhIL－6的条件为接种量为0．2％，溶氧350％， pH为6．5，rhlL－6的最大表达量为40％，纯度为98．5％，比活达5 X 10U加g。所建立的发酵条件和纯化流程适合中等规模生产。 2．ss－PEG修饰可提高rhIL－6的半衰期和稳定性，ss－PEG－rhIL－6是 一种很有潜力的促血小板增殖药物。