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小球藻(Chlorella vulgaris)是一种单细胞真核绿藻,属于绿藻门(Chlorophyta)绿藻纲(Chlorophyceae)绿球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻属(Chlorella)。本实验室从南极中山站附近分离纯化到一株普通小球藻(Chlorella vulgaris)NJ-7,与来自荷兰的温带株UTEX25918SrRNA基因序列完全一致,但具有更强的抗冻能力和在低温下生长的能力。本研究将两株小球藻进行比较,从小球藻南极株中鉴定了两个新的类似LEA的抗逆相关蛋白,并发现了小球藻南极株通过提高硝酸还原酶含量促进在低温下硝酸盐利用的适应策略。
本文的主要研究内容和结果分为2个部分:
第一部分,通过差减杂交,鉴定了两个在NJ-7中特异表达的LEA类似蛋白,并进行了初步的功能研究。
以在20℃光照培养的NJ-7和UTEX259为材料,利用抑制性差减杂交技术(SSH),构建了两株小球藻相互差减的cDNA片段文库。经过两轮点杂交筛选和测序,得到在NJ-7中高表达的122个基因的cDNA片段。Northern blot分析显示,Ccor1和Ccor2两个同源基因,在NJ-7中具有很高的表达水平。通过RACE技术得到了Ccor1和Ccor2的cDNA全长序列,通过同源性搜索发现Ccor1与大麦的一个胚胎发育后期高丰度蛋白(LEA蛋白)Dehydrin5有一定的同源性,但缺乏LEA蛋白的保守序列和重要结构域。尽管在序列上这两个蛋白与LEA蛋白没有很高的同源性,但Ccor1和Ccor2具有一些与LEA蛋白相似的特征:它们富含Gly,Glu或Lys残基,不含有或稀有Cys和Trp残基,预测具有高度的亲水性和高度的结构无序性。
从NJ-7和UTEX259基因组粘粒文库中筛选了包含这两个基因的克隆,测序发现在两株小球藻中,Ccor1和Ccor2属于一个基因簇并各有2个拷贝,不同的是NJ-7的这个基因簇含有5个同源基因,而UTEX259的这个基因簇含有6个同源基因。Southern blot分析发现,在NJ-7中除了这个基因簇,在基因组其他位点还存在着与Ccor1和Ccor2相似的基因,而在UTEX259中仅有这一个基因簇存在。
Northern blot检测显示,Ccor1和Ccor2基因的mRNA在NJ-7中受4℃低温诱导表达上调,但在UTEX259中无论是在4℃还是在20℃都不表达。Western blot检测显示,它们编码的蛋白也在NJ-7中受低温诱导显著上调,但在UTEX259中依然检测不到。此外,高盐胁迫也能诱导其在NJ-7中的表达。大多数LEA蛋白都是受低温或高盐胁迫诱导的,在表达模式上这两个蛋白也与LEA蛋白相似。
实验证明这两个蛋白具有很高的热稳定性,在沸水中加热20 min仍然可以保持可溶状态。另外,乳酸脱氢酶保护实验证明这两个蛋白可以作为抗冻保护剂,防止乳酸脱氢酶冻融失活。将两个基因在大肠杆菌中过量表达可提高其抗盐胁迫能力。
第二部分,小球藻南极株和温带株硝酸还原酶基因表达的比较。
比较了两株小球藻硝酸还原酶的基因序列,酶活性,蛋白含量和mRNA丰度,发现南极株NJ-7通过提高酶的含量来促进硝酸盐还原反应,弥补低温对酶活性造成的损失。这是NJ-7在适应南极低温环境过程中形成的一种进化适应策略。由于二者RNA水平非常接近,推测酶含量的增加是由翻译水平的改变引起的。
总之,本研究从小球藻南极株NJ-7中鉴定了两个LEA类似蛋白,这两个蛋白很可能与NJ-7抗冻、耐盐等抗逆特征相关；发现了NJ-7硝酸还原酶的进化适应策略,即通过提高酶含量来弥补低温对酶活性造成的损失。