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柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的柑橘衰退病是极具毁灭性的柑橘病害之一,它能导致树势衰弱、果实品质下降甚至树体死亡。到目前为止CTV已经给世界柑橘产区造成了巨大的经济损失。CTV主要通过感病接穗嫁接和蚜虫取食传播,其中以褐色橘蚜的传毒效率最高。CTV的全基因组具有12个开放阅读框,能编码CP、p13、p18、p20、p23和HEL等多种蛋白。CTV株系分化复杂,并具有多种基因型。寄主感染CTV后可因品种不同而表现出苗黄、茎陷点、速衰等不同症状。江西是柑橘种植大省,赣南地区种植了大量的甜橙,据前人研究CTV发生普遍;在江西赣南的崇义地区迄今还生存着丰富的野生柑橘品种,其是否携带CTV及其分子特征未见详细报道。本研究运用RFLP技术和基因型鉴定方法分析江西野生柑橘和栽培柑橘上携带的CTV组群的构成和基因型组成情况;通过RT-PCR扩增七个基因片段并测序,通过软件对两种不同生境中柑橘所携带的CTV进行序列分析,以明确野生柑橘和栽培柑橘上CTV的遗传多样性。主要实验结果如下:1、在赣州的10个县的柑橘果园采集‘纽荷尔’柑橘品种样品381份,在崇义聂都野生丛林采集野生柑橘样品44份。经DTBIA和RT-PCR检测发现栽培柑橘有122份感染了CTV,占样品总数的34.02%;野生柑橘有34份感染了CTV,占样品总数的77.3%。结果表明栽培柑橘感染CTV的情况普遍存在;野生柑橘也存在CTV感染情况,且感病率较高。2、RFLP技术分析122份栽培柑橘阳性样品和34份野生柑橘阳性样品的CTV组群构成情况,其中122份栽培柑橘样品CP/HinfⅠ酶切结果中84份样品表现出单一CP/HinfⅠRFLP组群构成,占鉴定样品总数的68.85%,以第1和第3组群为主,分别占样品总数的61.91%和28.57%;混合CP/HinfⅠRFLP组群样品占31.15%,以3和6混合组群为主,占混合组群的68.42%。34份野生柑橘阳性样品CP/HinfⅠ酶切结果中32份样品表现出单一CP/HinfⅠRFLP组群,占鉴定样品总数的94.12%,都是第3组群构成。结果表明栽培柑橘上CTV CP/HinfⅠRFLP组群组群构成比野生柑橘的复杂,多数以混合组群构成为主。其中3组群的CTV为野生柑橘上的主要株系,1、3、6组群的CTV为栽培柑橘上的主要株系。3、用Hilf和Roy设计的引物对122份栽培柑橘阳性样品和34份野生柑橘阳性样品的CTV进行基因型分析。Roy引物鉴定结果显示34份野生柑橘中有10份样品仅包含一种基因型,剩下24份样品包含了两种或两种以上的基因型。强毒株基因型混合组合有10份,强弱毒株的基因型混合组合14份。栽培柑橘中有35份样品包含一种基因型,剩下87份样品混合两种或两种以上基因型;其中有11份样品为强弱毒株混合,76份样品为强毒株混合。Hilf引物鉴定结果显示野生柑橘样品1份未鉴定出基因型,有22份样品鉴定为单基因型,11份样品包含了两种或三种基因型;鉴定结果中还发现VT(22份)和T3(12份)比较多,强弱毒株基因型混合样品有7份,强毒株基因型混合样品4份。栽培柑橘样品中15份未鉴定出基因型,57份样品为单基因型;50份样品为多基因型。混合组合中强弱毒株基因型组合样品7份,强毒株基因型组合样品43份;VT(90份)和T36(46份)基因型样品较多。综合两组数据显示:野生柑橘和栽培柑橘都包含了VT、T3、T30、T36、B165这五种基因型,且都存在一种基因型或多种基因型混合侵染的情况。栽培柑橘样品分离株中VT型最多,T36型其次;野生柑橘样品则是VT型最多,T36型最少。田间栽培柑橘以强毒株混合侵染比较多,达86%;野生柑橘以强弱毒株混合侵染比较多,达58.3%~63.6%。野生柑橘和栽培柑橘CTV分离株中并没有发现单一弱毒株的存在,均与强毒株混合侵染。4、将34份野生柑橘阳性样品和随机选取50份栽培柑橘阳性样品扩增CP、p13、p18、p20、p23、POL和HEL基因并测序,分析序列发现:CP、p13、p18、p20和POL基因序列在野生柑橘组群内的相似性略高于栽培柑橘组群内的相似性,遗传距离小于栽培柑橘组群内的。野生柑橘和栽培柑橘CTV分离株的CP、p13、p18、p20和HEL基因的d_N/d _S值均小于1,处于净化选择,POL和p23基因的d_N/d_S值大于1,处于正向选择。Fu and Li’s D、Fu and Li’s F和Tajima’s D检测发现国外柑橘CTV群体CP、p23、POL、HEL基因片段参数值为正数,其结果不显著,剩余各CTV种群基因片段参数值都是负值,且结果也不显著,说明近年来CTV没有经历明显的种群扩张,种群处于平稳状态。野生柑橘7个基因片段(CP、p13、p18、p20、p23、POL、HEL)的遗传多样性指数pi分别为0.02325、0.03621、0.02819、0.01591、0.03795、0.05518、0.1154,国内栽培柑橘的遗传多样性指数pi分别为0.05295、0.06354、0.05411、0.05447、0.06697、0.10227、0.1037,野生柑橘CP、p13、p18、p20、p23、POL基因的遗传多样性指数pi要明显小于国内栽培柑橘的。同时数据显示野生柑橘种群同国外栽培柑橘种群的Fst值7个基因片段(CP、p13、p18、p20、p23、POL、HEL)分别为0.1906、0.1380、0.2307、0.2834、0.1836、0.2282、0.1211,国内栽培柑橘种群同国外栽培柑橘种群间的Fst值7个基因片段分别为0.0267、0.0186、0.0674、0.0373、0.0293、0.0395、0.1337,其中野生柑橘种群同国外栽培柑橘种群CP、p13、p18、p20、p23、POL基因的Fst值均明显大于国内栽培柑橘种群同国外栽培柑橘种群间的,说明国内栽培柑橘CTV种群的CP、p13、p18、p20、POL、p23基因流比野生柑橘的高。综合上述说明:栽培柑橘CTV序列遗传多样性要比野生柑橘的复杂,CTV序列变异程度要比野生柑橘大。