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苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)属于杆状病毒科 a-杆状病毒属。ac75 是 AcMNPV的第75个开放阅读框(open reading frame,ORF),其同源基因存在于所有感染鳞翅目和膜翅目昆虫的杆状病毒病毒基因组中,功能未知。本文构建了ac75基因缺失突变体,通过对ac75缺失突变体的系列实验分析,对ac75在AcMNPV复制中的作用进行了初步探究。ac75位于AcMNPV基因组上一个包含10个同向排列的ORF的基因簇(ORF73-82)中,全长 402 bp(63126-63527 nt),与相邻的 ac74 和 ac76 互不重叠,编码133个氨基酸残基(amino acid,aa)。通过序列分析发现在ac75 ORF上游-15 nt,-94 nt,-139 nt和-142 nt四处存在典型的晚期启动子核心序列TAAG。Blast检索分析结果显示,aac75的预期编码产物与其它杆状病毒同源物的序列相似度高达90%～99%。通过SignalIP软件分析,在AC75的氨基酸序列中没有发现信号肽序列。利用NCBI保守结构域检索程序发现AC75序列中存在一个功能未知的DUF1160超家族结构域。用野生型AcMNPV感染性细胞培养上清液接种新鲜Sf9细胞培养,定时收集和裂解细胞,将细胞裂解物做SDS-PAGE,用AC75特异性抗体通过western-blot检测AC75,结果显示,在感染后12 h收集的细胞裂解物中开始检测到AC75条带,在感染后36 h的样品中AC75的检出量达到最大,体现晚期基因表达特征。利用λ-Red重组系统将一拷贝细菌氯霉素乙酰转移酶基因(chloraamphenicol,cat)插入AcMNPV bacmid替代ac75 ORF 5’-端229nt序列,再利用Bac-to-Bac系统将一拷贝与AcMNPV g16启动子相连的egfp或一拷贝多角体蛋白基因(polh)插入ac75缺失突变体构建带荧光标记或polh的aac75缺失突变体vAcac75ko-gfp和vAcac75ko-PH；利用Bac-to-Bac系统将一拷贝aac75连同egfp或polh插入ac75缺失突变体的polh位点构建ac75缺失异位回复突变体vAcac75ko-rep-gfp和vAcac75ko-rep-PH。将野生型、缺失突变体和缺失回复突变体分别对Sf9细胞做转染-感染实验,发现被ac75缺失突变体转染的细胞培养没有产生感染性芽殖型病毒体(BV)但被转染细胞中有包涵体产生。对被转染细胞培养上清液的实时荧光定量PCR分析结果显示,ac75缺失突变体转染的细胞培养没有BV释放。细胞超薄切片电镜分析结果显示,在ac75缺失回复突变体转染的Sf9细胞核中可见病毒形态发生不同阶段的典型特征;在ac75缺失体转染的细胞核中也可以看到明显的病毒发生基质,其中含有核衣壳,在病毒发生基质外围环状区域可见大量核衣壳,但没有观察到获得包膜的核衣壳,也未见有微泡结构,在多角体中也没有观察到病毒粒子。对被转染细胞内DNA的荧光定量PCR分析结果显示,在转染后24 h之内,ac75缺失突变体转染细胞与野生型转染细胞中病毒DNA增量大致相同;表明ac75缺失对病毒DNA复制无明显影响。将一拷贝绿色荧光蛋白编码序列(enhance green fuorescent protein,egfp)与ac75的3’端连接后插入AcMNPV基因组构建表达AC75-EGFP融合蛋白的荧光报告病毒vAcac75ko-ac75:gfp-PH。vAcac75ko-ac75:gfp-PH感染的Sf9细胞的激光共聚焦显微镜分析结果显示,在感染后12h绿色荧光主要见于细胞质中,在感染后18h开始进入细胞核中,在感染后24h主要存在于细胞核中,在感染后72h荧光几乎全部进入细胞核中。为了确定ac75是否涉及病毒晚期基因表达调节,用荧光素酶ORF(lucifearse,luc)作为报告基因分别与AcMNPV晚期基因vp39、p6.9、e18、gp64、an、pk1和polh启动子连接后插入ac75缺失突变体和gp64缺失突变体构建报告bacmids。用这些bacmids分别感染Sf9细胞,在感染后不同时间点取样测定荧光素酶活性。结果显示,所有包含报告基因的ac75缺失突变体转染细胞的荧光素酶活性值与对应的包含报告基因的gp64缺失突变体转染细胞相近;表明ac75的缺失对这些晚期基因的表达没有明显影响。上述实验结果表明,ac75是一个病毒复制必需基因,其功能可能与核内囊膜发生和核衣壳被囊膜包被的过程有关。