DON诱导的小麦TaPDR1基因的克隆和特征分析以及二穗短柄草多倍体中PDR1基因的系统进化

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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,简称DON)在小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)发病过程中起重要作用,是一种毒性因子。禾谷镰刀菌的侵染能力依赖于其产生DON的能力,DON单独处理即可引起较典型的赤霉病症状,抗病品种能显著地降低病穗组织中DON的含量,因而具有不同FHB抗性的品种其籽粒中DON含量也有很大的差别。现在已经发现了一些和抗毒素或降解毒素积累相关的基因,但由于小麦抗DON是个复杂的数量性状,而且小麦抗赤霉病和抗DON的机理还不清楚,所以从小麦中鉴定一些新的对DON反应密切相关的基因显得尤为重要。本研究以高抗赤霉病小麦品种望水白为材料,利用SMART技术构建了DON诱导的小麦穗组织λ噬菌体cDNA文库,旨在揭示DON诱导后小麦基因的表达特点并克隆相关的基因。未扩增文库的滴度大约为3×106,扩增后文库的滴度大约为2×109,平均插入片段1053bp,文库以19个混合池保存。改进了基于PCR的噬菌体cDNA文库筛选方法,用液体分装的方法,替代了的文库筛选的关键步骤—涂板分区,省去了噬菌体文库铺平板、浸染、培养、划块洗脱的操作过程,使筛库的工作量减少,速度和效率提高。利用Affymetrix小麦基因组芯片对高抗赤霉病小麦品种望水白经DON诱导后穗组织基因表达特点进行了分析,结果发现,一个编码PDR型转运蛋白的EST受DON诱导后上调表达45倍。根据该EST设计引物筛选小麦基因组TAC文库,得到一个包含该基因的TAC单克隆。利用染色体walking对该单克隆测序,用Softberry软件进行基因预测,根据预测基因的5’和3’非翻译区设计引物,从DON诱导的小麦望水白穗组织cDNA中克隆出该转运蛋白基因。该基因基因组全长7377bp,包含19个外显子,CDS长度为4308bp,编码1435aa、分子量161kDa的蛋白质,蛋白序列比对表明该蛋白属于PDR蛋白家族,将该基因命名为TaPDR1(Triticum asetivum Pleiotropic Drug Resistance)。利用一套中国春缺体-四体系将TaPDR1基因定位在小麦5A染色体上。半定量RT-PCR表明TaPDR1在望水白穗中受DON和禾谷镰刀菌诱导表达,表明其参与了植物抗病防御反应。该基因在望水白感病突变体中低水平表达进一步证明TaPDR1与赤霉病抗性有关。TaPDR1的表达不受与生物胁迫相关的激素如JA和SA、非生物胁迫因子如热、冷、伤害和NaCl的诱导。但TaPDR1受到Al3+和游离Ca2+的诱导表达,推测[ca2+]i介导了TaPDR1的表达信号。进一步构建了双链RNA干扰载体,通过农杆菌介导转化小麦,初步研究了该基因的功能。二穗短柄草(短柄草)是一种禾本科新的模式植物,本研究开发了一个可以在小麦和短柄草中通用的PDR1基因特异引物TR2。从23份短柄草中克隆出39个PDR1同源基因片段,通过对这些基因序列的比对分析,发现PDR1基因在短柄草中高度保守,同源性在95%-99%。利用在PDR1基因中找到的SNP位点设计了两个CAPS标记,可以区分来自于短柄草不同染色体组的PDR1基因的两个拷贝。利用这两个CAPS标记可以将这些同源基因分成两种类型E型和H型,系统分析表明每一种类型形成一个组,支持率很高,推测六倍体短柄草中的PDR1基因的2个拷贝分别来自于2个染色体组,试验中的二倍体可能就是六倍体基因组中的一个染色体组的供体。PDR1基因的两个拷贝在多倍体中的进化速度不同,显示这两种类型在年代上的差异,或两种类型的突变率或受到的选择压不同,系统分析同样表明,六倍体短柄草中的E型PDR1基因有一个共同的染色体组起源,而六倍体短柄草中的H型PDR1基因是多起源的。以上结果反映了短柄草复杂的多倍体进化历史。利用这两类PDR1基因片段的合并序列,重建了六倍体短柄草的系统进化树。
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