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由禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype-4,FAd V-4)引起的肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)自1987年在巴基斯坦安卡拉被发现以来已经在世界多个国家和地区暴发,给世界家禽养殖业造成巨大经济损失和安全威胁。该病呈急性感染,感染鸡出现严重的肝炎和心包积液。目前对该病毒的致病机制以及病毒与宿主细胞的相互作用知之甚少,并且目前世界范围内防控该病主要使用传统灭活疫苗。因此,FAd V-4致病机制的研究和新型疫苗的研发对防控该病显得尤为重要。本研究利用转录组学技术和生物信息学方法分析了FAd V-4感染LMH细胞后不同时间点的差异表达基因,探索了FAd V-4感染引起炎症反应的机制。并且构建了火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)疫苗株HVT-FC126细菌人工染色体,向HVT基因组插入FAd V-4免疫原性基因penton,成功构建了基因工程二价疫苗。动物试验表明该重组病毒对FAd V-4强毒攻毒可以提供一定的保护。本研究为FAd V-4的致病机制研究和新型疫苗的研发提供基础。1.FAd V-4感染LMH细胞的转录组学研究本研究利用二代测序首次对FAd V-4强毒株感染LMH细胞12h,24h和48h样品进行转录组学分析。结果显示,三个时间点共鉴定出7000个差异表达基因。12h感染组有1356个差异表达基因;24h感染组有3143个差异表达基因;48h感染组有6348个差异表达基因。进一步分析发现,这些差异表达基因参与代谢、天然免疫、炎症反应和信号转导等一系列生物学进程。其中与宿主细胞天然免疫和信号转导相关的信号通路有Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路和细胞因子-细胞因子受体互作信号通路等。在感染的三个时间点发现TLR2A、TLR3、TLR5、My D88、IL-12B、IL-12RB2、IL-5RA、IL-18、IL-21R、CCL20、CXCL14等细胞因子和细胞因子受体基因差异表达,这些差异表达基因可能与FAd V-4导致的炎症反应密切相关。本研究为进一步揭示FAd V-4致病机制奠定基础。2.FAd V-4感染诱导的炎症反应肝脏是FAd V-4的主要靶器官之一,FAd V-4感染主要引起嗜碱性包涵体肝炎。为进一步验证Toll样受体、My D88以及相关炎性因子参与病毒感染过程,用FAd V-4感染SPF鸡,实时荧光定量检测感染后12h,24h和48h肝脏组织中TLR2A、TLR3、TLR5、My D88、IL-12B、IL-15、IL-18、CCL20、TNFRSF21、CD30在肝脏中的转录水平。结果显示,肝脏中这些基因至少一个时间点显著上调或下调,并且整体表达趋势与病毒感染细胞转录组结果一致。同时发现,感染的肝脏中,My D88在感染后24h和48h显著上调6.60倍和30.20倍。在LMH细胞中用si RNA沉默My D88,下游细胞因子IL12B、IL18、CCL20和CXCL14的表达显著下调,证实My D88参与FAd V-4感染引起的炎症反应。3.火鸡疱疹病毒重组FAd V-4 Penton基因工程疫苗研究本研究以火鸡疱疹病毒疫苗株HVT-FC126株作为载体,将带有egfp和gpt筛选标记基因的线性化BAC质粒插入到HVT基因组US2区,构建含有HVT基因组的BAC化病毒载体(p HVT-BAC)。在大肠杆菌GS1783菌株里运用Red/ET同源重组技术,将含有Penton基因的表达盒插入到HVT基因组UL45和UL46基因间隙,成功构建重组质粒p HVT-BAC-Penton。随后在CEF细胞上转染质粒p HVT-BAC-Penton,成功拯救出重组病毒r HVT-BAC-Penton。向接种r HVT-BAC-Penton的细胞内转染表达Cre酶的质粒,利用Cre/lox P重组技术删除BAC骨架,最终通过克隆环空斑纯化成功筛选不含BAC骨架的重组病毒r HVT–Penton。动物试验结果显示,每羽免疫104和105 PFU剂量的重组病毒能完全抵抗MDV强毒攻毒,同时对FAd V-4强毒攻毒的保护率为40%和60%。免疫重组病毒可刺激机体产生针对Penton蛋白的抗体,并且在免疫后能诱导机体产生差异显著的CD4+T淋巴细胞,免疫105 PFU重组病毒能显著诱导CD4+T和CD8+T淋巴细胞产生。火鸡疱疹病毒载体HVT-FC126重组FAd V-4 Penton基因的基因工程二价活载体的成功构建,为FAd V-4新型基因工程疫苗提供新思路,同时为以HVT-FC126为载体表达FAd V-4的其它免疫原性基因提供了技术平台,对防控HHS具有重要意义。