[研究背景]卵巢癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一,其死亡率居妇科恶性肿瘤之首。上皮性卵巢癌是卵巢恶性肿瘤中最常见的病理类型,也是预后最差的一类。究其原因是发病隐匿,缺乏有效的早期诊断策略。目前临床上使用的生物标记物在上皮性卵巢癌早期诊断、预后判断等方面的作用仍然十分有限,因此,发现新的生物标记物,探讨上皮性卵巢癌的发生、发展机制,将为上皮性卵巢癌的早期诊断、治疗、预后评估等方面提供积极的帮助。以高通量为特点的二代测序（Next-Generation Sequencing,NGS）是测序技术发展史上的一个里程碑,能对几十万甚至几百万条分子同时进行序列测定,这一技术已广泛应用于基因组测序、转录组测序和基因表达调控等领域的研究,为现代生命科学研究提供了前所未有的机遇。液体活检（Liquid biopsy）是一项富有挑战性的新技术,通过捕获进入外周血的循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell,CTC）、血浆游离 DNA（cellfree DNA,cfDNA）和外泌体（Exosome）等,可以用于疾病的诊断,疗效和预后的判断等,这一新兴技术在NGS和精准医疗的推动下发展迅猛。在NGS技术支撑下,人类疾病的研究正从传统的假说导向型向数据驱动型转变,这样的思路大大减少了科研设计的随机性和盲目性,由此推动的基因和蛋白质等组学研究正在改变人类疾病研究及临床治疗的模式及进程。本研究利用NGS技术,探究上皮性卵巢癌的基因组突变特征;通过分析转录组数据,筛选出上皮性卵巢癌组织中差异表达显著的基因,并进一步探讨其对上皮性卵巢癌恶性生物学行为的影响及调节机制。有助于深入理解上皮性卵巢癌发生、发展的复杂性,对寻找卵巢癌新的关键基因和调节通路、推动卵巢癌诊断和治疗的进步具有重要意义。第一章上皮性卵巢癌的基因组特征[目的]探究上皮性卵巢癌患者的基因组特征。[方法]1.收集相关临床资料,纳入符合研究条件的上皮性卵巢癌患者。术前留取患者周血,术中留取双侧卵巢癌肿瘤组织（双侧卵巢癌患者）或患侧卵巢癌组织和对侧正常卵巢组织（单侧卵巢癌患者）,提取组织中的DNA/RNA以及外周血中的 Buffy coat DNA。注:上皮性卵巢癌全面分期手术范围包括:全子宫、双侧卵巢、双侧输卵管、大网膜切除+腹膜后淋巴结清扫（肾静脉水平）+切除任何肉眼可疑病灶。2.利用NGS技术进行外显子测序和转录组测序,获得基因组全外显子数据和转录组数据。单侧卵巢癌患者,采用对侧正常卵巢组织DNA为对照;双侧卵巢癌患者,采用患者外周血中Buffy coatDNA为对照。测序平台是Illumina公司的HiSeq 3000,Sanger测序法进行验证。对突变基因进行生物信息学分析。3.分析并筛选出在DNA水平有突变、同时在RNA转录上有差异的基因进行 GO（Gene Ontology,GO,基因本体）聚类分析和 Reactome 通路、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG,京都基因与基因组百科全书数据库）通路富集分析。[结果]1.共有31例上皮性卵巢癌患者的DNA和RNA样本进行了NGS。31例患者中,单侧肿瘤有13例,双侧肿瘤有18例。其中有18例为临床Ⅲ期（58.07%）,2例为Ⅳ期（6.45%）,其余11例为Ⅰ-Ⅱ期。病例收集从2016年2月开始至2017年1月,随访至2019年12月,中位随访时间41个月,其中死亡11例,存活患者中有7例因肿瘤复发而接受再次治疗。结果表明大部分上皮性卵巢癌患者诊断时已属中晚期,治疗效果不佳,预后差。2.外显子测序样本为31对（肿瘤组织DNA31份,对照样本包括正常卵巢组织DNA 13份和buffycoat DNA 18份）,共检出体细胞单核苷酸突变（single nucleotide variants,SNV）1598个,其中TP53、FAM83H-AS1、KRTAP4-3、FBXW10和ZNF814基因上的五个突变位点在2个以上患者中检出。3.排除同义突变及在千人基因组和外显子组整合联合数据库中频率大于1%的位点后,最终筛选到463个潜在致病位点,分布于437个基因,平均每个基因的突变位点为1.06（1-9）个。TP53有9个突变位点,其中一个为新的SNV （TP53:NM₀01126115:exon3:c.C346T:p.R116W）4.437个在DNA水平存在突变的基因中,同时在转录组水平有差异的有117个。对117个基因进行通路分析,GO聚类分析结果显示,117个差异基因多富集在胚胎器官发育形成及细胞纤毛的功能组。KEGG通路富集结果显示,MAPK（mitogen-activated protein kinase,MAPK,丝裂原活化蛋白激酶）和PI3K-Akt（Phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K-Akt,磷脂酰肌醇3-蛋白激酶）通路是主要的富集通路。Reactome通路分析中,止血、胶原蛋白形成、血管壁的细胞表面交互作用和细胞外基质降解是基因最主要的富集通路。第二章差异表达基因EPS8L1的筛选和鉴定[目的]筛选并鉴定与上皮性卵巢癌发生、发展相关的差异基因。[方法]1.分析转录组数据,筛选差异基因。2.采用qRT-PCR和Westernblot技术,验证差异基因在卵巢癌及正常卵巢组织标本中的表达。3.采用组织芯片免疫组化技术,检测差异基因在卵巢癌及正常卵巢组织标本中的表达。4.提取外周血cfDNA,Qubit2000荧光定量仪检测cfDNA浓度;采用qPCR检测cfDNA中差异基因的水平。5.分析差异基因与临床病理指标及患者生存的关系。[结果]1.转录组数据中,基于31个肿瘤样本对比10个正常卵巢样本（T vs N）,共找到4963个差异基因;基于单侧卵巢癌可配对的10对样本配对组的10对样本（T vs N_paired）中共找到4028个差异基因。通过文献查新、基因功能以及对肿瘤潜在影响等多方面因素综合考量,最终选取可能参与上皮性卵巢癌发生、发展的差异基因EPS8L1（Epidermal growth factor receptor kinase substrate 8-like protein 1,EPS8L1,表皮生长因子受体激酶底物8类蛋白1）开展进一步的研究。2.qRT-PCR结果显示,EPS8L1-mRNA在卵巢癌组织中的表达比正常卵巢组织增加了3.17倍（p<0.001）,Westernblot结果显示EPS8L1-protein在卵巢癌组织中表达升高了2.79倍（p<0.001）。3.组织芯片免疫组化结果显示,EPS8L1蛋白定位于细胞质。123例卵巢恶性肿瘤组织中,EPS8L1染色为阳性的有120例（97.56%）,其中强阳性有41例（33.33%）。60例正常卵巢组织中EPS8L1染色为阳性的有11例（18.3%）,但均为弱阳性,其余49例均为阴性。卵巢癌组织的EPS8L1阳性率显著高于正常卵巢组织（p＜0.05）。4.cfDNA检测结果显示,有淋巴结和远处转移的晚期患者（Ⅲ期+Ⅳ期）,其外周血中cfDNA的浓度和EPS8L1-cfDNA水平均较早期患者（Ⅰ期+Ⅱ期）要高,差异有显著性（p<0.05）。5.临床病理指标分析结果显示,EPS8L1-mRNA水平与患者的年龄,肿瘤部位（单/双侧）无关,而与患者的肿瘤组织类型、FIGO分期（Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO,国际妇产科联盟）和淋巴结转移等病理指标相关。根据随访信息绘制Kaplan-meier’s生存分析图,结果提示,EPS8L1高表达患者的生存期显著低于低表达患者（38个月vs 41.5个月,p<0.05）。第三章EPS8L1基因对上皮性卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响[目的]以人上皮性卵巢癌细胞株为模型,研究EPS8L1基因对细胞恶性生物学行为的影响。[方法]1.采用qRT-PCR和Westernblot技术,检测EPS8L1在人正常卵巢上皮细胞（IOSE80）和6株上皮性卵巢癌细胞（3AO、SKOV3、CAOV3、A2780、OVCAR3、HO8910）中的基础表达水平。2.利用慢病毒构建EPS8L1敲低（EPS8L1-Si）和过表达（EPS8L1-OE）的稳转细胞株模型,并进行鉴定。3.采用CCK-8法,检测EPS8L1对卵巢癌细胞增殖能力的影响。4.采用软琼脂克隆形成实验,检测EPS8L1对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响。5.采用流式细胞术,检测EPS8L1对卵巢癌细胞凋亡的影响。6.采用Transwell实验,检测EPS8L1对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响。7.采用Western Blot技术,检测EPS8L1对上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白表达的影响。[结果]1.qRT-PCR和Western blot检测结果均显示,6株人上皮性卵巢癌细胞株中EPS8L1的表达水平均显著高于人正常卵巢上皮细胞株。在检测的6株卵巢癌细胞中,EPS8L1在SKOV3细胞株中的表达水平相对较高,因此选择SKOV3进行后续实验。2.敲低EPS8L1,能显著抑制卵巢癌细胞SKOV3的恶性生物学行为,包括增殖、克隆形成、抗凋亡、迁移、侵袭和上皮间质转化;而过表达EPS8L1则显著促进卵巢癌细胞SKOV3的恶性生物学行为,显示出相反的结果。第四章基于MAPK和PI3K-Akt信号通路,研究EPS8L1调节卵巢癌细胞恶性生物学行为的分子机制[目的]根据第一章通路富集的结果,基于MAPK和PI3K-Akt信号通路,在细胞水平研究EPS8L1基因调节卵巢癌细胞恶性生物学行为的分子机制。[方法]1.利用RT2 ProfilerTM PCR Array,检测EPS8L1敲低/过表达对MAPK和PI3K/Akt信号通路相关基因转录的影响。2.采用Western blot技术,检测EPS8L1敲低/过表达对MAPK和PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响。3.利用信号通路激活剂和抑制剂,探究EPS8L1影响卵巢癌细胞增殖、克隆形成、抗凋亡、迁移、侵袭和上皮间质转化与MAPK和PI3K-Akt通路的关系。[结果]1.ProfilerTM PCR Array检测结果显示,MAPK通路中受EPS8L1显著影响的基因为CDKN2D、CDKN2A、ETS1 和GRB2;PI3K/Akt通路中受EPS8L1 显著影响的基因为RAF1、ADAR和EIF4E。过表达EPS8L1显著促进MAPK和PI3K/Akt信号通路的活化,而敲低EPS8L1则抑制了MAPK和PI3K/Akt信号通路的活性。2.MAPK和PI3K/Akt信号通路激活剂EGF和IGF-1均能显著逆转由于敲低EPS8L1所导致的卵巢癌细胞恶性生物学行为的抑制作用;而MAPK和PI3K/Akt信号通路抑制剂U0126-EtOH和PI-103则显著削弱由于过表达EPS8L1对卵巢癌细胞恶性生物学行为的促进作用。第五章EPS8L1基因对卵巢癌细胞体内成瘤能力的影响及机制[目的]研究EPS8L1对卵巢癌细胞SKOV3裸鼠体内成瘤能力的影响及机制[方法]1.构建EPS8L1敲低/过表达的裸鼠移植瘤模型,采用裸鼠成瘤实验验证EPS8L1对卵巢癌细胞体内成瘤能力的影响。2.采用TUNEL染色,检测EPS8L1对肿瘤组织细胞凋亡的影响。3.采用MAPK和PI3K/Akt激活剂EGF和IGF-1腹腔注射EPS8L1敲低组裸鼠,研究EPS8L1影响卵巢癌细胞体内成瘤能力的机制。[结果]1.敲低EPS8L1显著降低SKOV3细胞在BALB/c裸鼠皮下的成瘤能力,而过表达EPS8L1则显示相反的结果。2.敲低EPS8L1显著增加裸鼠皮下肿瘤的细胞凋亡,而过表达EPS8L1则显示相反的结果3.裸鼠腹腔注射MAPK和PI3K/Akt激活剂,可显著恢复EPS8L1敲低组裸鼠皮下移植瘤的生长,削弱敲低EPS8L1对裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。总结与结论1.上皮性卵巢癌患者具有特异的单核苷酸突变位点和异常的基因表达谱,MAPK和PI3K-Akt通路是差异基因最主要的富集通路。2.EPS8L1基因与上皮性卵巢癌发生、发展相关,它在上皮性卵巢癌组织中呈高表达,与肿瘤的组织类型、淋巴结转移、临床分期和患者预后相关。同时外周血中EPS8L1-cfDNA的水平亦与肿瘤的发生发展相关,有望成为上皮性卵巢癌新的生物标志物。3.机制研究表明,EPS8L1在细胞和动物模型中均可通过促进MAPK和PI3K-Akt信号转导通路的激活,进而增强上皮性卵巢癌细胞的恶性生物学行为,促进肿瘤的生长。综上,我们认为EPS8L1是上皮性卵巢癌的高响应基因,对卵巢癌的诊断、进展及预后评估具有重要的参考价值,值得进一步研究。