【摘 要】
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目的:探讨重组的人胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(IGF-IR)的反义基因对乳腺癌细胞内源性IGF-1R表达的抑制作用。 方法:设计含有BamH1和HindⅢ酶切位点的一对引物,通过逆RT-PCR
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目的:探讨重组的人胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(IGF-IR)的反义基因对乳腺癌细胞内源性IGF-1R表达的抑制作用。 方法:设计含有BamH1和HindⅢ酶切位点的一对引物,通过逆RT-PCR获得IGF-IR cDNA片段。经过纯化的hIGF-IR cDNA和空载体pcDNA3.1(-)经过BamH1和HindⅢ双酶切,连接,转化,鉴定而得到重组体。体外构建人IGF-IR的反义基因真核表达载体pIGF-IR/As,并转染人MCF-7乳腺癌细胞,经G418筛选而获得稳定表达外源性反义基因的新细胞株MCF-7/AS,在基因水平和蛋白质水平检测内源性IGF-IR的表达情况。 结果:反义基因重组体经过BamH1和HindⅢ双酶切后,得到700bp和5.4kb两条带;以重组体为模板进行PCR,700bp的目的基因片段呈现强阳性;重组体测序的结果与预期结果完全一致。证实IGF-IR的反义基因真核表达载体pIGF-IR/As构建成功。RT-PCR显示MCF-7转染前后IGF-IRmRNA的表达水平分别为(0.71±0.04)和(0.43±0.06),表达明显下降(P<0.05);Western blot显示其蛋白质的表达水平呈相同的变化趋势(P<0.01)。 结论:本实验构建的载体pIGF-IR/As能够稳定转染MCF-7细胞,所表达的IGF-IR的反义基因能够在基因和蛋白质水平显著抑制内源性IGF-IR的表达。
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