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目的:探究Encorafenib(LGX818)对体外培养的携有BRAFV600E突变体的恶性黑素瘤细胞增殖作用的影响及其相关作用机制。方法:1.培养携有BRAFV600E突变体的恶性黑素瘤细胞株:A375、G361,实验组用Encorafenib(LGX818)处理,对照组加同等量DMSO。以下所有实验均重复3次。2.MTT、克隆形成实验检测LGX818对A375、G361细胞株增殖的影响。3.流式细胞术Annexin-V/PI双染法检测LGX818对A375、G361细胞株凋亡的影响。4.流式细胞术PI单染法检测LGX818对A375、G361细胞株细胞周期的影响。5.β-半乳糖苷酶染色实验检测LGX818对A375、G361细胞株衰老作用的影响。6.透射电镜检测LGX818对A375、G361细胞株自噬小体产生情况的影响。7.Western Blot检测LGX818对A375、G361细胞株中p-Erk1/2蛋白表达,细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDC6、CDK2,衰老通路相关蛋白p27、p21、p Rb,凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3、p53,自噬相关蛋白LC3、p62、p-m TOR、pp70S6K的表达情况的影响。8.敲低自噬相关基因LC3,建立LC3稳定沉默的细胞系A375/sh LC3和G361/sh LC3,LGX818处理细胞后,β-半乳糖苷酶染色实验观察LC3沉默对LGX818诱导的细胞衰老作用的影响,Western Blot检测衰老通路相关蛋白p27、p21、p Rb的变化。结果:1.MTT、克隆形成实验检测到LGX818可以抑制A375、G361细胞株的增殖活性。2.流式细胞术PI单染法检测到LGX818可导致A375、G361细胞株细胞周期阻滞于G1期。3.流式细胞术Annexin-V/PI双染法检测到LGX818不能引起A375、G361细胞株发生凋亡。4.β-半乳糖苷酶染色实验检测到LGX818能导致A375、G361细胞株发生细胞衰老。5.透射电镜检测到LGX818能诱导A375、G361细胞株产生自噬小体。6.Western Blot检测到LGX818可以抑制A375、G361细胞株中p-Erk1/2蛋白表达,抑制ERK/MAPK通路活性;下调细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDC6使细胞周期阻滞在G1期;上调衰老通路相关蛋白p27,激活p Rb使细胞发生衰老;促进自噬相关蛋白LC3I、LC3II和p62的降解、抑制m TOR/70S6K通路活化,即减少p-m TOR、pp70S6K蛋白表达而使细胞发生自噬;且并未检测到裂解的PARP、Caspase-3及p53这些细胞凋亡相关蛋白的表达。7.沉默LC3抑制自噬作用后,β-半乳糖苷酶染色实验显示可使LGX818介导的细胞衰老作用减弱。Western Blot显示衰老通路相关蛋白p27表达下降、p Rb激活作用减弱。结论:BRAF抑制剂Encorafenib(LGX818)通过诱导细胞发生衰老并伴发自噬,从而抑制BRAFV600E基因突变的恶性黑素瘤细胞株增殖。因此,我们首次揭示了新一代BRAF抑制剂Encorafenib(LGX818)抑制BRAFV600E突变的恶性黑素瘤细胞增殖的一项作用机制,为Encorafenib(LGX818)作为治疗携有BRAFV600E基因突变的黑色素瘤患者提供了分子生物学理论基础。