【摘 要】
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目的:轻度胎盘低灌注（Mild intrauterine hypoperfusion,MIUH）是发生在孕中期的多种复杂性双胎并发症和胎儿异常的共同病理特征,例如双胎输血综合征中的供血胎儿、选择性生长受限胎儿、双胎一胎胎死宫内的存活儿、胎盘血管瘤等等。并且随着孕中期胎儿宫内治疗和胎儿手术的快速发展,医源性造成孕中期MIUH的病例数量日益增多,例如胎儿镜胎盘血管凝固术、射频消融减胎术及胎儿镜下膈疝修
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目的:轻度胎盘低灌注（Mild intrauterine hypoperfusion,MIUH）是发生在孕中期的多种复杂性双胎并发症和胎儿异常的共同病理特征,例如双胎输血综合征中的供血胎儿、选择性生长受限胎儿、双胎一胎胎死宫内的存活儿、胎盘血管瘤等等。并且随着孕中期胎儿宫内治疗和胎儿手术的快速发展,医源性造成孕中期MIUH的病例数量日益增多,例如胎儿镜胎盘血管凝固术、射频消融减胎术及胎儿镜下膈疝修补术等等,这些治疗均能在一定程度上造成MIUH的状态。目前的临床观察已经发现,这些在孕中期经历了例如双胎输血综合征、选择性生长受限以及单绒双胎减胎术后等MIUH的新生儿,其生后的学习记忆功能表现异常。因此,孕中期MIUH暴露对于子代神经发育的研究极具临床意义。经历了病理状态并存活下来的新生儿神经系统的远期预后更是研究的重点。目前对于MIUH通过何种方式影响子代的神经系统发育的机制尚不清楚,前期的研究主要集中在神经炎性介质、神经细胞微环境改变等方面,这些改变均可导致细胞内自噬水平异常。另外,孕中期是神经发育的关键时期,此时脑内神经发育的主要事件是神经干细胞的增殖、凋亡和分化,在这些事件中,起重要调节作用的正是细胞自噬。然而,目前缺乏MIUH对神经干细胞自噬影响方面的研究。因此本研究选择了大鼠孕中期MIUH模型,拟研究孕中期MIUH对子代大鼠脑内细胞自噬的影响。PI3K/Akt/mTOR信号通路是自噬的经典的、极其重要的负性调节通路。在哺乳动物细胞当中,PETN能够通过其脂类磷脂酶活性拮抗PI3K,进而调节细胞自噬水平。另外,作为肿瘤抑制因子,PETN能够负向调节孕中期鼠神经干细胞和神经前体细胞的增殖。PETN的缺失能够激活自噬的发生。因此本研究进一步探讨PTEN/Akt/m TOR信号通路在孕中期轻度胎盘低灌注大鼠子代脑内细胞自噬变化中的作用。研究方法:选择孕期为17.5天SD大鼠按随机数字表随机分成4组（n=15,共60只）:假手术组（Sham group）、胎盘低灌注组（MIUH group）、胎盘低灌注+3-MA组（MIUH+3-MA group）以及胎盘低灌注+bpv组（MIUH+bpV组）。建立孕中期轻度胎盘低灌注模型:孕鼠麻醉满意后,将长度2.5mm,内径0.24mm的弹簧圈环绕套于子宫动脉和卵巢子宫动脉上。模型建立结束后将孕鼠放回笼中饲养。MIUH处理前1h,MIUH+bpV组孕鼠腹腔注射PETN抑制剂bpV;MIUH+3-MA组孕鼠腹腔注射自噬抑制剂3-MA,其余组注射等量空白溶剂。取暴露处理后6小时胎鼠脑组织,使用投射电镜电镜观察子代脑内自噬小体和自噬溶酶体。对4个特定的时间点（6h后、24h后、48h后、72h后）的胎鼠脑组织PTEN、Akt、p-Akt、mTOR、Becilin-1、LC3BII、P62以及Nestin、Ki67、β-catenin、bcl-2等蛋白表达进行Western Blot检测。为明确神经干细胞的增殖、凋亡以及细胞自噬水平,对4个特定的时间点的胎鼠脑组织进行Nestin、LC3B、Ki67以及TUNEL免疫荧光染色。结果:1、孕中期轻度胎盘低灌注引起子代胎鼠脑内自噬激活,表现为自噬相关蛋白Becilin-1、LC3BII表达上调,自噬降解蛋白P62表达下降,神经干细胞内出现自噬溶酶体等特异性结构,神经干细胞内LC3B表达增多;2、孕中期MIUH能够抑制胎鼠脑内细胞增殖,上调凋亡水平,具体表现免疫荧光染色显示神经干细胞增殖数量减少,凋亡数量增多;蛋白水平检测发现Ki67、β-catenin等增殖相关蛋白表达下降,神经干细胞特异性蛋白Nestin表达下降;凋亡相关蛋白bcl-2表达下降;3、应用了自噬抑制剂3-MA通过减轻胎鼠脑内的自噬,从而减轻了神经干细胞增殖的抑制,缓解了神经干细胞凋亡的增多;4、孕中期轻度胎盘低灌注引起胎鼠脑内PTEN表达升高,p-Akt/Akt和m TOR表达下降;应用了PTEN抑制剂bpV,p-Akt/Akt和mTOR表达下降明显缓解,自噬激活明显减弱,神经干细胞的增殖及凋亡明显改善。结论:孕中期轻度胎盘低灌注可能是通过激活了PTEN/Akt/mTOR通路进而引起胎鼠脑内自噬激活,从而导致神经干细胞增殖抑制、凋亡增多。
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