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目的:新生儿缺氧缺血性（H/I）脑损伤是围产期窒息幸存者经常遇到的临床问题,可引起不同程度的神经损伤,从而导致认知障碍、癫痫、脑瘫、智力发育迟缓等。短暂性缺血缺氧可以引起严重的急性脑损伤,尤其是海马区对缺血缺氧极为敏感。然而,目前尚无新生儿缺氧缺血性脑损伤的有效治疗方法。右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）是一种选择性α2受体激动剂,在临床上可用于镇痛,镇静,抗焦虑。据报道,右美托咪定可通过α2受体来发挥神经保护作用。虽然右美托咪定的神经保护作用已被广泛证实,但是它的分子机制以及介导的信号通路仍需阐明。脑红蛋白（neuroglobin,Ngb）是一种存在于脊椎动物的球蛋白,在神经元中有丰富的表达,它对氧具有较高的亲和力,从而增加了对脑组织的供氧。最近有研究表明,Ngb在H/I损伤模型中过表达,对神经细胞的凋亡具有保护作用,减轻神经元的H/I损伤。因此,我们推测右美托咪定的神经保护作用可能与Ngb存在潜在联系,右美托咪定可能通过诱导Ngb表达,在H/I损伤的神经保护作用中发挥积极作用。低氧诱导因子（HIF-1α）是缺氧反应的主要调节器,可以调节一系列基因的表达,这些基因有助于对低氧环境及细胞存活的适应。它是一个常氧状态下降解的螺旋-环-螺旋（bHLH）结构的转录因子。然而,在缺氧的条件下,羟基化修饰下降,进而稳定了HIF-1α的转录活动。近年来,相关研究表明HIF-1α信号通路与缺氧性脑病的发病机制密切相关,其活化被认为与抑制神经元凋亡相关。因此,本课题研究构建了7日龄SD大鼠缺氧/复氧（H/R）损伤模型,模拟新生儿H/I脑损伤,然后将H/R模型暴露于不同剂量的右美托咪定,通过调节Ngb表达来评价右美托咪定是否有助于减轻新生儿H/I脑损伤,并进一步研究该作用是否通过α2受体与激活HIF-1α/p53信号通路有关。研究方法:1、7日龄健康的Sprague Dawley（SD）大鼠140只,体重为12-16g。随机分为5组（n=48）:C组（对照组）,H/R组（缺氧/复氧组）,D1组（缺氧/复氧+25μg/kg右美托咪定组）,D2组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定组）,和D3组（缺氧/复氧+75μg/kg右美托咪定组）。除C组外,其它各组均进行缺氧/复氧处理,吸入8%O2+92%N2 2小时,然后给予50%O2 30min。复氧结束后除外H/R组,D1组,D2组,D3组腹腔分别注射25μg/kg,50μg/kg,75μg/kg右美托咪定。2小时、24小时、48小时、72小时后用Western blot法和免疫组化法检测Ngb的表达,用Nissl染色观察大鼠海马CA1区的损伤情况,用Western blot法检测凋亡相关蛋白Cyt-c,APAF-1,Caspase-3的表达,用TUNEL荧光检测海马细胞凋亡情况。2、将7日龄健康的SD大鼠48只,随机分成4组（n=12）:C组（对照组）,H/R组（缺氧/复氧组）,D组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定组）和DY组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定+0.5mg/kg育亨宾组）。在缺氧/复氧后,D组腹腔注射50μg/kg右美托咪定,DY组腹腔注射50μg/kg右美托咪定及0.5mg/kgα2受体拮抗剂育亨宾。24小时后,用Western blot法检测凋亡相关蛋白Cyt-c,APAF-1,Caspase-3的表达,用TUNEL荧光检测海马细胞凋亡情况,用Western blot,免疫组化和免疫荧光检测Ngb,HIF-1α的表达,用Western blot法检测p53的表达。3、将7日龄健康的SD大鼠48只,随机分成4组（n=12）:C组（对照组）,H/R组（缺氧/复氧组）,D组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定组）和DM组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定+16mg/kg2-甲氧基雌二醇组）。在缺氧/复氧后,D组腹腔注射50μg/kg右美托咪定,DM组腹腔注射50μg/kg右美托咪定及16mg/kg HIF-1α的抑制剂2-甲氧基雌二醇（2ME2）。24小时后,用Western blot法检测凋亡相关蛋白Cyt-c,APAF-1,Caspase-3的表达,用TUNEL荧光检测海马细胞凋亡情况。用Western blot,免疫组化及免疫荧光检测通路相关蛋白Ngb,HIF-1α的表达,用Western blot法检测p53的表达。4、五组大鼠,即C组,H/R组,D组,DY组和DM组,每组10只,于出生后28天用Morris水迷宫测试大鼠远期空间学习记忆能力。结果:1、Western blot分析显示,与C组相比,H/R组各时间点Ngb表达均上调（p<0.05）。与H/R组相比,中、高剂量的右美托咪定使Ngb表达显著上调（p<0.05）,而低剂量的右美托咪定对Ngb的表达没有明显影响（p>0.05）。在免疫组化分析中也发现了类似的结果。Nissl染色结果显示:在复氧后2h、24h,C组神经元含有丰富的Nissl体,H/R模型组Nissl体减少、解体甚至消失,神经元数量较C组减少,提示H/R模型建立后海马神经元受损。当右美托咪定低剂量作用于H/R模型时,Nissl体仍然减少并解体,神经元数量减少。中、高剂量右美托咪定处理H/R模型时,Nissl体重新出现并增加,神经元数目较H/R组增加,神经元呈颗粒状分布。在缺氧/复氧后2h、24h,与C组相比,H/R组Cyt-c、APAF-1、Caspase-3的表达明显增加（p<0.05）。右美托咪定低剂量暴露后,Cyt-c、APAF-1、Caspase-3表达无明显变化（p>0.05）。中、高剂量右美托咪定处理H/R模型时,与H/R组相比,Cyt-c、APAF-1、Caspase-3表达明显受到抑制（p<0.05）,在缺氧/复氧后48h,72h,各组之间Cyt-c、APAF-1、Caspase-3的表达无统计学意义（p>0.05）。TUNEL荧光染色结果显示:在缺氧/复氧后2h,24h,与C组相比,H/R组海马细胞凋亡率较C组增加（p<0.05）。虽然D1组对细胞凋亡无影响（p>0.05）,但D2、D3组能明显抑制细胞凋亡（p<0.05）。在缺氧/复氧后48h,72h,各组之间海马细胞凋亡率无统计学意义（p>0.05）。2、应用α2受体拮抗剂育亨宾后,与D组相比,DY组凋亡相关蛋白Cyt-c,APAF-1,Caspase-3表达增加,TUNEL结果显示,D组染色强度低于DY组,凋亡也低于DY组（p<0.05）。与H/R组相比,D组Ngb、HIF-1α和p53蛋白表达明显增高（p<0.05）。然而,育亨宾治疗后,与D组相比,DY组Ngb、HIF-1α和p53的蛋白表达明显降低（p<0.05）。Ngb,HIF-1α在免疫组化和免疫荧光分析中发现类似的结果。3、应用HIF-1α的抑制剂2-甲氧基雌二醇（2ME2）后,Western blot分析显示,与D组比较,DM组海马组织中Cyt-c,APAF-1,Caspase-3蛋白表达明显升高（p<0.05）。TUNEL结果显示,D组染色强度低于DM组,凋亡也低于DM组（p<0.05）。Western blot分析显示,加入2ME2后,Ngb,HIF-1α和p53蛋白表达显著降低（p<0.05）。Ngb,HIF-1α免疫组化及免疫荧光观察出现类似的变化。4、为探讨右美托咪定对H/R损伤大鼠长期学习记忆的影响,新生大鼠于28天进行水迷宫实验。结果发现,与H/R组比较,D组大鼠第5天的逃避潜伏期明显缩短,第6天的穿越平台次数明显增多（p<0.05）。而与D组相比,DY组和DM组第5天逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数明显减少（p<0.05）。结论:右美托咪定在大鼠H/R损伤中具有诱导Ngb表达的药理作用,且具有剂量依赖性。此外,右美托咪定介导的Ngb上调抑制了Cyt-c、APAF-1和Caspase-3表达,抑制细胞凋亡。通过α2受体拮抗剂育亨宾干预,Cyt-c、APAF-1和Caspase-3表达明显升高,Ngb表达下降。当HIF-1α信号通路被抑制,右美托咪定促进HIF-1α,p53,Ngb表达的作用消失。此外,应用育亨宾或2-甲氧基雌二醇,可逆转右美托咪定对H/R损伤大鼠空间学习和记忆功能的改善作用。由此可见,右美托咪定在治疗新生儿缺氧性脑病时可能通过α2受体激活HIF-1α/p53信号通路上调Ngb表达而发挥作用。