【摘 要】
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COVID-19是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一种严重呼吸道疾病,目前正在全球快速传播并严重影响人类的健康。SARS-CoV-2是一种具有正向单链RNA的包膜病毒,在结构上它具有一个包含S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的双层脂质包膜,其中S蛋白以三聚体的形式形成病毒表面的刺突糖蛋白。SARS-CoV-2主要是通过上呼吸道或面部粘膜表面进入细胞,其表面的S蛋白上S1亚基的受体结合结构域
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COVID-19是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一种严重呼吸道疾病,目前正在全球快速传播并严重影响人类的健康。SARS-CoV-2是一种具有正向单链RNA的包膜病毒,在结构上它具有一个包含S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的双层脂质包膜,其中S蛋白以三聚体的形式形成病毒表面的刺突糖蛋白。SARS-CoV-2主要是通过上呼吸道或面部粘膜表面进入细胞,其表面的S蛋白上S1亚基的受体结合结构域（RBD）与ACE2上的受体结合基序（RBM）结合,S蛋白的S2亚基则介导病毒与细胞膜的融合。SARS-CoV-2侵染细胞后,病毒遗传物质和蛋白质脱壳,病毒释放RNA进入宿主细胞并在宿主细胞内翻译包括RNA依赖性聚合酶在内的蛋白质,然后进行转录和装配,随后进行病毒脱落以完成复制周期。纳米抗体是一种只包含重链可变区（VHH）的单域抗体,它是通过分子克隆从天然存在于骆驼体内的只包含重链的重链抗体得到的。纳米抗体具有传统抗体所具备的功能,并且与传统抗体相比,纳米抗体分子量更小、稳定性更高、组织渗透性更强。除此之外,纳米抗体还具有溶解度高、容易制备等特点,也正因为因其独特的结构和功能,纳米抗体被广泛应用于肿瘤的诊断与治疗中。本文将SARS-CoV-2与纳米抗体联系在一起,旨在获得几种不同的SARS-CoV-2的RBD结构域的中和纳米抗体并从结构的角度阐述其作用机理。通过分子克隆构建了SARS-CoV-2表面S蛋白RBD结构域的表达质粒,在HEK-293-F细胞中表达后分离纯化得到了纯度较高的RBD。利用RBD对双峰骆驼进行了七次注射免疫,从其外周血中提取RNA并合成c DNA,最终构建了一个库容为1.33×108CFU/m L的包含抗RBD的纳米抗体在内的抗体文库。通过噬菌体展示技术,利用RBD对构建的抗体文库进行了两轮免疫筛选,展示抗RBD的纳米抗体基因的噬菌体富集度达到了116.7。随后用噬菌体侵染后TG1,挑取950个单菌落小量表达纳米抗体,通过ELISA鉴定以及序列比对,获得了32个CDR3区域不同的抗RBD的纳米抗体。利用HPLC对32个纳米抗体进行表位分析并通过Octet对纳米抗体进行亲和力测定,确定了1A7和1B11这两个亲和力较高且与RBD结合在不同表位的纳米抗体,其中1A7的KD值为0.74±0.003 nM,1B11的KD值为6.76±0.027n M。将1A7和1B11与RBD形成复合物后通过X衍射解析了两种复合物的结构,确定了1A7和1B11与RBD不同的结合表位,并且认为这两种纳米抗体可以在空间位置上阻碍RBD与ACE2的结合。最后通过SARS-CoV-2假病毒实验对1A7和1B11进行了活性验证,确定这两个纳米抗体均可以抑制RBD与ACE2的结合。本文通过筛选得到了SARS-CoV-2的RBD结构域的中和纳米抗体,从结构生物学的角度分析了1A7和1B11与RBD的互作表位,解释了两种不同的纳米抗体以何种方式阻断RBD与ACE2的结合,并从功能上验证了纳米抗体的中和活性,为后续针对SARS-CoV-2的诊断治疗以及药物开发奠定了重要的基础。
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