第一部分肿瘤免疫治疗药物IDO抑制剂的筛选背景:在肿瘤的发生发展过程中,癌细胞可以通过多种免疫逃脱机制避免被机体免疫系统清除。在正常人体内,吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是一种存在于细胞内可以催化色氨酸通过犬尿氨酸通路代谢的酶,肿瘤引发的炎症会诱导肿瘤微环境中的树突状细胞和肿瘤细胞持续高表达IDO,使肿瘤微环境中的色氨酸持续消耗,抑制对色氨酸敏感的T细胞的功能活性,进而抑制肿瘤组织局部的免疫活性,最终导致癌细胞逃脱免疫细胞的杀伤。抑制IDO的活性及其表达可以有效激活免疫系统对肿瘤的杀伤作用,因此,IDO成为了肿瘤免疫治疗的一个新靶点。目前针对IDO的抑制剂已经有Epacadostat、Indoximod、GDC-0919和BMS-986205进入临床试验阶段,并有望作为肿瘤分子免疫治疗药物上市用于癌症的治疗。目的:分别建立分子水平以及细胞水平上的IDO抑制剂的筛选模型,开展IDO抑制剂的筛选工作。方法:1、利用原核表达系统表达人源重组IDO1蛋白,以His-Tag标签对蛋白进行分离纯化,通过方法2中实验验证IDO1的酶活性,用于后续蛋白水平上的IDO抑制剂的筛选。2、通过比色法检测酶学反应体系中IDO1酶促反应产物犬尿氨酸的浓度可以反映IDO1本身的酶活性,在不同浓度的待测化合物的作用下IDO1的活性受到不同程度的抑制,通过药效曲线可以求得不同化合物的IC50。3、通过IFN-γ的刺激可以使得本身不表达IDO的He La细胞高表达IDO,通过比色法检测细胞培养液中的IDO酶促反应底物犬尿氨酸的浓度可以反映IDO1本身的酶活性,在不同浓度的待测化合物的作用下IDO1的活性受到不同程度的抑制,通过药效曲线可以求得不同化合物的IC50。结果:1、成功通过大肠杆菌原核表达系统表达并分离纯化得到了具有酶学活性的人源重组IDO1蛋白。2、利用分离纯化得到的具有酶学活性的IDO1蛋白,完成了酶学水平IDO1抑制剂筛选模型的构建,并成功筛选15个化合物,从中得到TT-00181具有良好的IDO1抑制活性。3、完成了细胞水平的IDO1抑制剂筛选模型的构建,对上述15个化合物在细胞水平筛选模型上进行筛选,发现TT-00181具有良好的IDO1抑制活性。结论:IDO通过其本身具有的酶学活性参与到肿瘤对机体的免疫逃脱当中,前期的研究表明,抑制肿瘤患者体内的IDO酶的活性可以在一定程度上缓解肿瘤组织对肿瘤微环境中的免疫抑制重新激活机体对于肿瘤细胞的免疫杀伤,因此,筛选并得到高效的IDO抑制剂是肿瘤免疫治疗的一个重要方向,本文建立了在分子以及细胞水平筛选IDO抑制剂的实验模型,对十几种化合物进行筛选,筛选得到活性化合物TT-00181,可有效抑制IDO活性。证明该筛选模型具有简便、直观的优点,可用于IDO抑制剂的筛选,为研发新型肿瘤分子免疫治疗药物提供了新方法。第二部分ES2抗结肠癌多药耐药作用及机理研究背景:在癌症的治疗过程中,肿瘤多药耐药的发生是化疗药物治疗肿瘤病人失败的一大重要原因,产生肿瘤多药耐药的一个重要机制就是肿瘤细胞P-糖蛋白(P-gp)家族成员的诱导性高表达,针对P-gp的抑制剂研发也是克服肿瘤多药耐药的重要方向之一。目前P-gp的抑制剂已经研发至第四代,但由于较高毒副作用的原因,至今没有P-gp抑制剂进入临床治疗阶段。丰富多样的天然产物具有化学结构多样性,毒副作用低等特点,因此,从天然产物中寻找低毒有效的耐药逆转剂也成为发现肿瘤多药耐药逆转剂的重要途径。结肠癌是我国高发癌症之一,结肠癌患者在接受化疗药物治疗后常常发生对多种化疗药物的耐药,极大程度上阻碍了对结肠癌患者的继续治疗,影响了患者的术后康复。ES2是从中国维吾尔族传统药物对叶大戟种子中提取的一种大环二萜类化合物,前期研究表明,ES2在乳腺癌以及人口腔鳞癌细胞的耐药细胞株上表现出了良好的耐药逆转效果。目的:ES2的前期研究表现出了良好的肿瘤多药耐药逆转活性,本研究目的是为了观察ES2对结肠癌耐药的逆转作用及其机制,在更多种类的肿瘤耐药细胞株上验证ES2逆转肿瘤多药耐药的作用,拓展ES2逆转肿瘤MDR的作用谱系,为ES2的后续研发提供更多的数据支持。方法:1、采用MMT法检测ES2对结肠癌耐药细胞株(HCT8/T细胞以及HCT8/VCR细胞)以及亲本细胞株(HCT8细胞)是否具有细胞毒性。2、采用MMT法检测在不同浓度ES2作用下,PTX,NVB,VCR,DDP等多种化疗药物作用于结肠癌耐药细胞株以及亲本细胞株时IC50的变化情况。3、采用荧光显微镜拍照实验,以及流式细胞术检测不同浓度ES2作用下结肠癌耐药细胞株以及亲本细胞株对罗丹明123的蓄积的影响。4、采用Western Blot以及q-PCR等方法检测当ES2在不同浓度或者相同浓度不同时间作用于结肠癌耐药细胞株时,结肠癌耐药细胞内ABCB1在m RNA表达水平以及蛋白表达水平上的变化。结果:1、ES2对于结肠癌耐药细胞株(HCT8/T细胞以及HCT8/VCR细胞)的细胞毒性极弱,与其作用在结肠癌亲本细胞株HCT8细胞上相当(IC50>30μM)。同时ES2表现出了极强的逆转结肠癌耐药细胞株多药耐药的活性,且呈现出一定的浓度依赖。相较于第一代耐药逆转剂维拉帕米,3μM的ES2逆转肿瘤多药耐药的活性和10μM的维拉帕米相当,10μM的ES2逆转肿瘤多药耐药的活性远强于10μM的维拉帕米。2、ES2能够有效地增强结肠癌耐药细胞株对于罗丹明123的蓄积,且3μM的ES2的效果与10μM的维拉帕米相当,10μM的ES2增强结肠癌耐药细胞株对于罗丹明123蓄积的效果远强于10μM的维拉帕米。3、ES2不影响结肠癌耐药细胞株中ABCB1的m RNA转录以及蛋白表达水平。结论:验证了ES2对于结肠癌的耐药细胞株具有良好的抗肿瘤多药耐药的作用,在与第一代耐药逆转剂维拉帕米的对比实验中可以发现,ES2表现出远超过维拉帕米的抗肿瘤多药耐药的活性。ES2能够有效抑制ABCB1的功能,抑制化疗药物被ABCB1排出细胞外,增加化疗药物在发生多药耐药的肿瘤细胞内的蓄积。ES2不影响ABCB1的表达,仅作为ABCB1的底物占据其有效位点,抑制ABCB1对于其他化疗药物的外排。研究证明了ES2能够逆转结肠癌细胞的多药耐药,拓宽了ES2抗肿瘤多药耐药的肿瘤种类,为ES2进一步的研发提供了前期基础。