枯草芽孢杆菌M-23对柑橘砂皮病的生防效果及其机理研究

来源 :湖南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:asdfghjkj
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近年来,柑橘砂皮病危害日趋严重,给我国柑橘产业造成了巨大的经济损失。为了解决柑橘产业面临的这一问题,研究柑橘砂皮病的生物防治方法迫在眉睫。本研究从有柑橘砂皮病发生的橘园中采集健康柑橘叶片,使用稀释分离、平板对峙的方法筛选出一株对柑橘砂皮病有较好抑制作用的生防菌株M-23,并采用传统形态学、生理生化反应结合分子生物学鉴定该菌,通过单因素控制法和多因素正交分析优化其发酵培养基配比和发酵条件,后续探究了M-23菌株的抑菌机制、田间防效和M-23菌株对柑橘叶际微生物多样性的影响,获得的主要结果如下:(1)一共从健康柑橘叶片内生菌中分离得到72株细菌,以柑橘砂皮病菌作为靶标菌株通过对峙培养的方法筛选得到抑制率最高的细菌M-23,该菌10倍、20倍稀释的发酵液对柑橘砂皮病菌的抑制率分别达到72.67%和61.80%。(2)通过传统形态学观察和生理生化反应检测,结果显示M-23菌株与芽孢杆菌的基本特征基本符合,再结合16S r DNA基因序列分析,将M-23菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。(3)通过单因素控制法和多因素正交分析确定了M-23菌株最佳发酵培养基成分配比为:葡萄糖15 g/L,酵母浸粉15 g/L,Na Cl 3.5 g/L,K2HPO4 1.5 g/L;最佳发酵条件:28℃、180 r/min、p H=7.5、发酵时间为72 h。(4)通过检测发现M-23菌株含有产表面活性素(Surfactin)、丰原素(Fengycin)、杆菌抗霉素(Bacillomycin)和伊枯草菌素(Iturin)4种抗菌脂肽的基因。对发酵上清液采用酸沉淀法、有机溶剂抽提获得的脂肽粗提液对柑橘砂皮病菌丝生长、孢子萌发均表现抑制作用。(5)M-23发酵液的田间试验中,稀释30倍的发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为79.09%,稀释50倍发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为68.97%。通过高通量测序分析叶际微生物群落多样性结果表明,柑橘叶际细菌主要由变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)组成,叶际真菌主要由子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)组成。在喷施生防菌发酵液后,叶际的微生物群落丰富度有所降低,但叶际微生物群落结构得到优化,枯草芽孢杆菌M-23能够在叶际得到良好的定殖,叶际细菌种群中芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度上升,叶际真菌种群中枝孢霉属(Cladosporium)的相对丰度得到显著上升。
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