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蜡样芽孢杆菌905(Bacillus cereus 905)是在小麦体内分离获得的一株有益芽孢杆菌,温室和田间应用结果显示,该细菌在小麦、水稻等很多作物上都表现出促生和防病效果,能在小麦根围稳定定殖。为深入研究该细菌定殖的分子基础,本研究选择从氧自由基毒性这一个角度,针对超氧化物歧化酶(SOD)这一氧自由基消除的关键酶在细菌中的生理功能及定殖小麦过程中的相关性进行分析探讨。
首先,利用功能互补的方法进行B.cereus 905 SOD基因的克隆。外源的SOD可以恢复SOD基因缺失大肠杆菌Escherichia coli QC779对过量自由基的抗性。构建该细菌的基因组粘粒文库,转染E.coli QC779,得到了两个不同的克隆表现出SOD活性。SOD化学抑制法鉴定和序列分析发现它们都是MnSOD,异源表达验证了DNA编码蛋白的SOD功能。比较这两个MnSOD序列(sodA-1和sodA-2),发现这两个MnSOD的序列的同源性很低,只有58.43%。他们与其它细菌来源的MnSOD的同源性也低于50%。分析它们可能独立进化的。
按双交换的突变方法,从工具载体pEBS的构建、突变思路的完善到转化参数的优化,建立了适用于芽孢杆菌的基因缺失体系。在该体系的基础上,构建了SOD突变菌株B.cereusKO1(△sodA-1)、B.cereus KO2(△sodA-2)和B.cereus KOS(AsodA-1 AsodA-2)。突变体SOD活性和组分的检测结果发现,这两种不同SOD占据细菌胞内的绝大部分SOD活性,MnSOD2在不同的处理下的活性都比MnSOD1的活性高出一倍多。过量的氧自由基不能明显诱导这两个基因的转录和表达。
最后,通过分析比较突变体菌株与原始菌株的生理变化和定殖能力,分析了MnSOD1和MnSOD2在细菌生理中的功能及与定殖的相关性。结果显示,较MnSOD1相比,MnSOD2在细菌应对各种环境,包括氧自由基胁迫、低营养等条件下,表现更为重要的功能。这种结果同样反映在细菌定殖小麦根围的比较结果中。结果表明MnSOD在细菌定殖过程发挥着不可缺失的作用。