研究目的:卵巢癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在各类妇科肿瘤中位居首位,严重威胁了妇科肿瘤患者的生命。虽然多年来卵巢癌的诊断和治疗手段已得到显著提高,但是卵巢癌的患者5年生存率仍仅为30%。卵巢癌患者的死因多是由于远处转移,然而对于卵巢癌远处转移的病理机制我们尚未完全清楚。因此,研究卵巢癌侵袭转移的机制并探索一个有效的监测指标对于卵巢癌的诊治是十分必要的。缺氧是实体肿瘤微环境的基本特征之一,在促进肿瘤进展、癌细胞侵袭转移中发挥着重要的作用。大量体外实验证明了缺氧能够产生和诱导某些蛋白酶,从而降解细胞外基质;临床研究也表明肿瘤缺氧与肿瘤转移倾向有一定的关系。缺氧诱导因子HIF-1 α(Hypoxia-inducible factor-1 α)是调节细胞内氧代谢的核心因子,在缺氧环境中表达上调,参与了肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的调控。HIF-1 α与多种肿瘤关系已经得到证实,但对卵巢癌细胞侵袭转移的影响尚未得到阐明。本研究将选择卵巢癌A2780细胞来检测缺氧环境下HIF-1 α对卵巢癌细胞侵袭转移的影响及其机制。研究方法:1.采用乏氧培养箱模拟肿瘤低氧微环境,分别在常氧和缺氧的环境中培养卵巢癌A2780细胞;2.通过实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(western blot)检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和基质金属蛋白酶13(MMP13)mRNA及蛋白的在常氧和缺氧环境中的表达情况;3.应用小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)转染卵巢癌 A2780 细胞,通过显微镜观察转染效率,并通过RT-PCR验证siRNA对A2780细胞HIF-1α基因抑制结果;4.通过 RT-PCR 和 western blot 检测 siRNA 干扰 HIF-1 α 基因后 MMP13 mRNA 及蛋白的表达变化;5.通过对穿过Transwell小室人工基底膜的细胞数目进行计数统计,比较常氧环境下与缺氧环境下卵巢癌细胞的侵袭转移能力,以及siRNA干扰HIF-1α基因前后卵巢癌细胞的侵袭转移能力。实验结果:1.卵巢癌A2780细胞中HIF-1α mRNA在正常氧环境中可见表达,HIF-1α的mRNA水平随缺氧时间的延长,表达水平逐渐升高;正常氧环境中HIF-1α蛋白表达较少,经缺氧培养后,A2780细胞中HIF-1α的蛋白含量明显增多,在缺氧处理24 h后其蛋白表达水平最高;2.应用FAM-siRNA转染A2780细胞,在显微镜下可观察到分布广泛的荧光,转染效率可达85%以上,说明siRNA成功转入A2780细胞并取得良好的转染效果;3.siRNA能够有效地抑制HIF-1α基因的表达,mRNA水平抑制率达到800%,蛋白水平抑制率达到60%以上;4.与常氧培养环境相比,缺氧环境培养卵巢癌细胞中MMP13在mRNA水平和蛋白水平均显著增多,经相关性分析,MMP13表达与HIF-1α呈正相关,Pearson相关系数为0.8813;siRNA抑制HIF-1 α表达后,MMP13 mRNA水平及蛋白水平表达均明显降低,;5.卵巢癌A2780细胞在缺氧环境下,与常氧组相比,侵袭穿膜的细胞数增加;经siRNA沉默HIF-1α表达后,缺氧环境中的卵巢癌细胞侵袭数明显减少;结论:低氧微环境使卵巢癌A2780细胞中HIF-1α表达增多,HIF-1α可能通过上调MMP13表达增强缺氧环境下卵巢癌细胞的侵袭能力。研究目的:树突状细胞是迄今发现的功能最强大的抗原提呈细胞。DC诱导初次免疫应答具有独特的功能,能够摄取加工提呈抗原,表达高水平的MHCⅠ和MHCⅡ类分子、多种共刺激分子和黏附分子等,启动T细胞介导的免疫反应。肿瘤DC疫苗可将外源性肿瘤抗原、免疫辅助因子导入DC,增强其提呈能为,从而产生特异性细胞毒性T淋巴细胞,完成对恶性肿瘤细胞的特异性杀伤作用。目前DC疫苗在肿瘤治疗中的应用己成为肺瘤免疫治疗的热点之一。尽管DC疫苗的研制和开发已经历数十年的发展,许多体外实验己经证实了DC疫苗具有很好的抗肿瘤效应,但是动物实验及临床实验并未取得预期的效果,不能抑制肿瘤的生长和转移,真正应用到临床实践的DC疫苗甚少,究其原因可能是DC在机体肿瘤微环境下发生了免疫耐受。了解肿瘤细胞及其微环境对DC的作用及其机制,进一步揭示肿瘤免疫耐受的机制,将有助于改进DC脚瘤免疫治疗的方法。研究方法:1.培养肿瘤细胞,收集肿瘤上清:肿瘤细胞常规传代培养,以l×10~6/ml的细胞浓度种于培养瓶中,24h后收集上清,冻存于-20℃冰箱中备用;DC培养基含50%肿瘤细胞培养上清模拟肿瘤微环境,不含有肿瘤细胞培养上清的DC培养基设为对照;2.小鼠骨髓来源DC的培养,显微镜观察DC形态:无菌分离小鼠股骨和腔骨,用RPMI1640培养基冲洗骨髓,获得骨髓细胞,去除红细胞后调整细胞浓度为l×10~6/ml,骨髓细胞在含GM-CSF和IL-4的培养基中培养48h后去除未贴壁细胞,更换含有GM-CSF和比-4的培养基继续培养4天,第6天添加LPS促进DC成熟,48h后收集悬浮细胞;3.流式细胞仪检测DC表面分子表达情况:收集成熟DC于流式管,用PBS洗涤后,加入荧光标记的CD80、CD86、MHCⅡ抗体腊育30min,上机检测;4.基因总片检测差异表达基因:收集两组DC,常规提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,与基固芯片杂交,经数据分析,获得两组细胞间差异表达的基因;5.验证差异表达基因的结果:采用RT-PCR对基因芯片检测结果在mRNA水平进行验证;Western blot法在蛋白水平检测其表达情况。实验结果:1.小鼠骨髓细胞经过细胞因子GM-CSF和IL-4的培养,LPS刺激成熟后逐渐向DC分化,显微镜下成熟DC为悬浮生长,树突状结构明显;经肿瘤细胞培养上清处理过的DC形态与对照组相比无明显差别;2.收集成熟DC进行流式细胞术检测,与对照组相比,经肿瘤细胞培养上清处理过的DC表面分子CD80、CD86、MHCⅡ表达均明显下调;3.收集两组DC提取总RNA,进行基因芯片检测,得到差异表达的基因;4.RT-PCR法验证差异表达的基因,与对照组相比,经肿瘤细胞培养上清处理过的DC,TRAF6在mRNA水平表达下调;Western blot检测显示在蛋白水平,TRAF6表达也是下调的;结论:DC成熟过程在肿瘤微环境中受到抑制可能是肿瘤免疫耐受的重要原因,而导致DC成熟障碍的可能机制是肿瘤微环境抑制了TRAF6在DC中的表达。