目前肿瘤治疗方法主要有手术、化疗、放疗和生物治疗。其中肿瘤生物治疗是目前研究的热点,具有良好的前景,树突状细胞(Dendritic Cell, DC)是肿瘤生物治疗的重点研究对象。树突状细胞是目前已知功能最强的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell, APC),其在肿瘤免疫中发挥重要作用。本课题将DC与肿瘤细胞融合制成瘤苗,使该融合细胞即表达肿瘤抗原又具有提呈抗原的能力。Exosomes为一种直径30-120nm大小的囊泡状物质,其中含有核酸和蛋白质。多种细胞已经被证实在体外都能向细胞外释放exosomes,包括：多种血细胞(B细胞、T细胞、树突状细胞、肥大细胞,血小板)、肠上皮细胞、施万细胞(schwann,又名雪旺细胞)、脂肪细胞、神经细胞、纤维母细胞和多种肿瘤细胞系[37-41]。目前在临床和实验研究中具有抗肿瘤作用的exosomes主要有两种,一是肿瘤细胞产生的exosomes (Tumor Derived Exosomes, TEX),因其含有许多肿瘤细胞所共有的肿瘤抗原,具有潜在的加强肿瘤细胞免疫原性、促进抗肿瘤免疫的作用[42]；二是DCs来源的exosomes (Dendritic Cells Derived Exosomes,DEX)。也有研究表明,某些肿瘤细胞和不成熟树突状细胞来源的exosomes不能有效增强机体免疫,甚至具有免疫耐受作用。因此,exosomes是否具有抗肿瘤免疫效应,不仅与其来源细胞的特点和功能状态有关,也需要对获得的exosomes进行体内外试验进行功能验证。考虑到DC细胞的抗原提呈能力和肿瘤细胞易增殖的特点,有研究者采用杂交瘤技术将DC与骨髓瘤细胞融合制成瘤苗,即克服了DC细胞分离提取和培养困难的问题,也克服了肿瘤细胞免疫原性弱、抗原提呈能力差的弱点,在体内外研究上都显示出了抗肿瘤效应。但该融合细胞分泌exosomes是否具有融合细胞膜标志的特点、是否具有抗肿瘤作用,报道尚少。本文将骨髓瘤细胞和DC融合,再提取融合细胞分泌的exosomes进行抗肿瘤效应研究。目的为获得理化性质稳定、耐高温、制备时可质控,较细胞性瘤苗更具优越性的肿瘤治疗疫苗,本文通过收集DC/肿瘤细胞融合细胞上清液,分离提取exosomes,并对其进行鉴定和抗肿瘤效应研究,以期为DC/肿瘤细胞融合疫苗的应用开辟新的途径。方法1.DC的提取和培养：取6-8周BALB/c雄性小鼠,无菌分离股骨、胫骨和腓骨,髓腔冲洗获得骨髓细胞,静置24h,去除未贴壁细胞,将贴壁细胞培养于含10%胎牛血清DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养液中,加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF)20ng/ml,白细胞介素-4(Interleukin4, IL-4)10ng/ml,诱导其向DC分化。2.骨髓瘤sp2/0细胞培养：从液氮中取出细胞株,复苏后在含10%胎牛血清DMEM培养液中培养,融合前用8-氮鸟嘌呤(8-Azaguanine,8-AG)处理两周。3.DC与sp2/0细胞融合及鉴定：使用聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)化学融合法与电融合法相结合的方法制备DC/sp2/0融合细胞。流式细胞仪分析融合效率,激光共聚焦鉴定融合细胞。4.DC/sp2/0融合细胞的培养：融合后将细胞移入96孔板,使用含1%HAT(H-Hypoxanthine次黄嘌呤,A-Aminopterin甲氨喋呤,T-Thymidine胸腺嘧啶核苷)的10%胎牛血清DMEM选择培养基培养14天,改用含1%HT(H-Hypoxanthine次黄嘌呤,T-Thymidine胸腺嘧啶核苷)的10%胎牛血清DMEM选择培养基培养7天,再改用正常10%胎牛血清DMEM培养基培养。培养期间加入GM-CSF100ng/ml.5.Exosomes的提取及鉴定：收集经筛选后的融合细胞上清,采用密度梯度离心法[15],提取上清液中exosomes,运用紫外分光光度仪对exosomes进行定量,用投射电镜观察exosomes形态,运用SDS-PAGE和western blot对exosomes进行鉴定。6.T淋巴细胞分离和培养：自6-8周BALB/c雄性小鼠脾脏中分离单个核细胞,尼龙毛吸附法获得T细胞,含IL-2(30μg/ml)的10%胎牛血清DMEM培养液进行培养。7.T淋巴细胞增殖实验：在T淋巴细胞培养液中加入exosomes,并用MTT比色法检测T细胞增殖。8.DCex、imDCex及融合细胞Exosomes对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响：将T淋巴细胞培养液中分别加入DCex、imDCex和exosomes,6天后取三组T淋巴细胞作为效应细胞,进行CTL杀伤试验。设单独T细胞、骨髓瘤细胞为对照。使用MTT比色法检测T细胞靶细胞杀伤能力。9.实验结果用统计学软件SPSS13.0分析。结果1.DC与sp2/0细胞融合及鉴定：小鼠骨髓贴壁细胞经GM-CSF、IL-4体外诱导培养7d,呈现典型形态特征的DCs；与骨髓瘤细胞融合效率经流式细胞仪检测为45%左右,激光共聚焦显微镜下见到了双阳性的融合细胞。2. DC/sp2/0融合细胞分泌exosomes的提取和鉴定：融合细胞呈贴壁生长,类圆形,收集上清提取exosomes经western blot鉴定显示,融合细胞分泌的exosomes携带有MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子。对照组sp2/0细胞分泌的exosomes不带有MHC-Ⅱ分子。3.T淋巴细胞增殖实验：融合细胞分泌的exosomes和成熟DCs来源的exosomes有显著促进T细胞增殖的作用,且与exosomes的剂量呈正相关,与对照组相比P<0.01。未成熟DC分泌的exosomes不具有促进T细胞增殖的能力,与对照组相比,无显著差异,P>0.05。4.CTL实验：融合细胞分泌的exosomes和成熟DC来源的exosomes能诱导出CTL杀伤活性,与对照组相比,有显著性差异,P<0.01；效靶比例以50：1时对靶细胞杀伤能力最强。未成熟DC分泌的exosomes不具有活化CTL的能力,与对照组相比,无显著差异,P>0.05。结论DC/sp2/0融合细胞能够分泌exosomes,该融合细胞分泌的exosomes有显著促进T细胞增殖的作用,并能诱导出CTL杀伤活性。