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EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)即表皮生长因子受体,是一种具有酪氨酸激酶活性的受体,当它与相应的配体如EGF(Epidermal Growth Factor,表皮生长因子)、TGF-α(TranslationalGrowth Factor-α,转化生长因子-α)等结合后,将信号传递到细胞内,使细胞正常生长繁殖。当EGFR过表达或突变,则会造成EGFR的异常活化,这种活性特征与癌细胞的生长、抗凋亡、迁移和侵袭关系密切,因此,使它成为肿瘤治疗的热门靶标。已有西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panituzumab)两种单抗与吉菲替尼、伊马替尼两种小分子药物上市。由于这两类药物所靶向的区域存在较高的突变,加之单抗要面临配体的竞争性结合,使得目前上市的药物存在临床反应率低、产生耐药的问题。因此,急需开发新的药物。EGFR分子的主要组成区域有胞外区、跨膜区、胞内区。胞外区为配体结合区域,胞内区为酪氨酸激酶活性区域。胞外区又可分为四个亚域,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个亚域。在没有配体结合时,Ⅱ和Ⅳ亚域相互结合,使整个分子呈无活性状态。当有配体结合时,Ⅰ和Ⅲ亚域与配体结合,Ⅱ和Ⅳ亚域分开,其中Ⅱ亚域向外舒展,露出与另一分子相互作用的二聚化臂。当另一EGFR分子或EGFR家族其他分子也暴露出二聚化臂并相互靠近时,两分子的二聚化臂会相互作用,从而结成二聚体并将信号向下游传递。二聚化是EGFR及其家族其他受体激活的关键过程。靶向EGFR二聚化界面,阻止两分子的二聚化,从而抑止EGFR分子的活化,可以获得更好的抑瘤效果。在部分EGFR异常表达的肿瘤细胞表面,也常常伴随着EGFR家族另一个分子HER2的过表达。HER2结构与EGFR类似,但没有特异性配体,它的胞外始终暴露着二聚化臂。这就使得它成为EGFR分子二聚化的一个重要对象。在前期的研究中,我们项目组构建了靶向EGFR二聚化界面的单链抗体,通过实验验证了它能有效抑制EGFR过表达的肿瘤细胞的生长,但对EGFR和HER2同时过表达的肿瘤细胞抑制效果不甚理想。本项目在前期“靶向EGFR二聚化界面”的研究基础上,提出利用双特异性单链抗体同时靶向EGFR和HER2二聚化界面,以研究该双特异性单链抗体的抑瘤效果和作用机制,以期为EGFR异常表达肿瘤的治疗提供新的参考。目的:1.重组双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv工程菌构建;2.双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv的高效制备;3.双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv与肿瘤细胞特异性结合分析;4.双特异性单链抗体EGFR-HER2-dimer-bis-ScFv对肿瘤细胞的抑制活性分析;5.双特异性单链抗体抗受体二聚化分析和抗受体磷酸化分析。方法:1.重组双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv工程菌构建以实验室筛选的单克隆抗体EGFR dimer 5G9的基因序列为双特异性单链抗体靶向EGFR二聚化界面序列的基因序列母本,以已经上市的单克隆抗体Pertuzumab(帕妥珠单抗)为双特异性单链抗体靶向HER2二聚化界面序列的基因序列母本,再在序列的3’端加入His标签及酶切位点序列,5’端加入MF-α信号肽和酶切位点序列。PCR法扩增目的基因,酶切并连接到pGAPZαA表达载体。重组表达载体经鉴定、纯化后电转化到毕赤酵母菌X-33菌株(pGAPZαA,X-33)中,经高抗性筛选和SDS-PAGE检测筛选到能表达出靶向EGFR及HER2二聚化界面的双特异性单链抗体的工程菌。2.双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv的高效制备运用微生物发酵技术,对表达EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv的工程菌进行小规模的摇瓶发酵。采用单因素实验,对发酵的温度,pH值,装液量以及碳源进行考察,通过测定OD600值以及SDS-PAGE蛋白电泳检测,比较不同条件下的菌体生物量和蛋白产物量,从而得出相对较优的发酵条件。对双特异性单链抗体进行生物信息学分析,得出其等电点及稳定性影响因素后,采用弱阳离子交换层析和镍离子金属亲和层析进行纯化,利用分子筛层析置换样品缓冲液并进行保存。3.双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-sc Fv与肿瘤细胞特异性结合分析选用EGFR和HER2均过表达的人肺癌NCI-H292细胞做阳性实验组细胞,小鼠成纤维细胞NIH-3T3做阴性对照组细胞,用完全培养基养至细胞丰度为80%后,用2‰的血清培养基饥饿细胞24 h。每瓶收集大约1x106个细胞,用脱脂奶粉封闭细胞2 h,然后分别加入0.02136,0.2136和2.136μmol/L浓度为1 mg/mL的EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv作为一抗,His Tag标签免疫组化荧光抗体作为二抗对细胞分别孵育1 h,洗涤之后,用流式细胞仪对细胞的结合活性检测并分析。4.双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv对肿瘤细胞的抑制活性分析将肺癌细胞NCI-H292培养至适宜浓度,以2000个/孔的细胞浓度种至96孔板,经24小时的血清饥饿培养后,加入终浓度为1.1μmol/L的EGF,再分别加入终浓度为0.0668、0.134、0.267、0.534、1.068和2.136μmol/L的EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv和EGFR-Dimer-scFv培养72小时,同时用饥饿后的小鼠成纤维细胞NIH-3T3加入终浓度为1.1μmol/L的EGF和2.136μmol/L的EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv和EGFR-Dimer-scFv培养72小时作为阴性对照。MTT法检测抗体对不同细胞的增殖抑制。5.双特异性单链抗体抗受体二聚化分析和抗受体磷酸化分析选取EGFR及HER2过表达的人肺癌细胞NCI-H292培养后消化至6孔板中,血清饥饿24h,加入1.1μmol/L EGF配体,之后再分别加入2.136μmol/L的EGFR-Dimer-scFv和EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv,24小时后加入8 mmol/L的BS~3的交联剂交联30 min,裂解制样后用SDS-PAGE,Western blot检测受体二聚化变化情况。同样方法培养细胞和给药后,4℃下分别培养6,12和24 h。裂解取上清,用Western blot方法分析EGFR以及HER2的磷酸化情况。结果:1.重组双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv工程菌构建基于靶向EGFR二聚化界面的单抗EGFR-Dimer-5G9和靶向HER2二聚化界面的单抗Pertuzumab的可变区序列,设计出了靶向EGFR和HER2二聚化界面的双特异性单链抗体的基因序列,全长1518 bp,经密码子考察、化学合成后,亚克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA中,经菌落PCR和测序鉴定后,重组表达载体p GAPZαA-EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv被线性化并电转化入毕赤酵母X-33细胞中。SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot结果显示,目的蛋白得到了正确表达,大小约为55.6 kD,与预期大小相符,能被抗His标签抗体所识别,特异性也符合预期。以上结果表明,成功构建了双特异性单链抗体工程菌。2.双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv的高效制备双特异性单链抗体的高效制备既与工程菌的高密度高表达发酵条件有关,又与后续的纯化工艺有关。经本实验研究,双特异性单链抗体工程菌在发酵温度为28℃,pH值为6.0,装液量为15%,以及采取2.0%的葡萄糖为碳源时,可获得较高的生物量和较大的目的蛋白表达量,与考察前的发酵条件相比,蛋白表达量提高1.69倍。双特异性单链抗体经生物信息学分析,其等电点为7.96,带有His表达标签,适宜用阳离子交换层析和金属离子亲和层析纯化,故发酵上清经CM弱阳离子交换层析和Ni2+亲和层析纯化后,获得95%以上的纯度。考察后目的蛋白的产量为6.6 mg/L。3.双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv与肿瘤细胞特异性结合分析流式细胞仪分析结果表明,双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-sc Fv可特异性地结合到EGFR和HER2均过表达的人肺癌NCI-H292细胞上,而不结合到EGFR和HER2低表达的小鼠成纤维细胞NIH-3T3上,说明双特异性单链抗体的靶向性好。4.双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv对肿瘤细胞的抑制活性分析MTT试验结果表明,双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv对EGFR、HER2均过表达的典型细胞株NCI-H292有高达52.66±1.89%的生长抑制作用,且这种抑制作用呈浓度依赖关系。双特异性单链抗体的抑制能力显著高于实验室前期制备的单链抗体EGFR-Dimer-scFv,后者的最高生长抑制率为45.01±0.55%。5.双特异性单链抗体抗受体二聚化分析和抗受体磷酸化分析Western Blot的结果表明,相比于仅靶向于EGFR二聚化界面单链抗体EGFR-Dimer-scFv,双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv有更强的二聚体抑制作用以及EGFR和HER2受体磷酸化的抑制作用。结论:1.成功制备出了靶向EGFR和HER2二聚化界面的双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-sc Fv,其纯度可达95%,发酵条件考察考察后的工程菌生物量提高了约27.89%,产物表达量提高了约1.69倍。为工业化大规模生产该类型抗体提供了新思路。2.双特异性单链抗体EGFR-HER2-Dimer-bis-scFv可以特异性的结合细胞表面的EGFR和HER2受体,并有效抑制EGFR和HER2过表达肿瘤细胞NCI-H292的增殖,这种抑制作用强于仅靶向EGFR二聚化界面的单链抗体,究其原因,可能在于双特异性单链抗体有更强的抗EGFR和HER2二聚化及抗EGFR和HER2受体磷酸化的能力。