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背景:1型糖尿病(T1DM)是一种慢性系统性炎症性疾病,最终导致免疫系统对抗自身抗原的失调。T1DM脏器损伤的主要靶器官为视网膜、大脑、心脏和肾脏。有着较高的发病率和致死率的急性肾损伤(AKI)最常见的原因是缺血/再灌注(I/R)损伤。无论是移植或创伤,在同种异体移植肾和自体肾中,肾缺血再灌注均是导致临床不良转归最常见的因素。AKI时肾损伤激活先天免疫和获得性免疫导致肾脏炎症反应是共同的途径。大量临床研究表明,糖尿病是急性肾损伤的高危因素,糖尿病患者对急性肾损伤有较高的易感性并且预后差。糖尿病和缺血性AKI的病理机制都包含细胞凋亡、细胞坏死与炎症反应等。已知细胞凋亡和细胞坏死是调节炎症反应的主要因素。I/R时,细胞坏死后,促进具有特征性的炎性细胞因子和趋化因子大量释放,这种炎症过程包括粘附分子蛋白表达上调,白细胞聚集到缺血后肾脏。TLR7作为重要的模式识别受体在机体抵御病原体入侵中发挥重要作用。大量研究表明TLR7参与多种疾病的发病机制包括系统性红斑狼疮肾病,自身免疫性肾病,冠脉缺血再灌注损伤等。然而TLR7介导TLR7/MyD88/NF-κB信号转导通路活化是否参与糖尿病模型缺血再灌注性AKI尚未见相关研究。因此,TLR7参与糖尿病缺血性急性肾损伤中的作用机制亟待研究。第一部分 Toll样受体7在1型糖尿病大鼠肾缺血再灌注损伤中的作用机制研究目的:观察TLR7在1型糖尿病大鼠模型下急性缺血性肾损伤中的作用。研究TLR7/MyD88/NF-κB信号转导通路在急性肾损伤中的重要作用机制。方法:雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠采用STZ单次腹腔注射法建立1型糖尿病模型,年龄配对的非糖尿病正常大鼠作为对照组。采用双侧肾蒂夹闭25分钟建立肾缺血再灌注损伤模型。其中一部分糖尿病大鼠缺血再灌注损伤前腹腔注射氯喹预处理7日。糖尿病大鼠和正常大鼠随机分为5组(n=6):①非糖尿病大鼠假手术组(ND+Sham);②糖尿病大鼠假手术组(DM+Sham);③非糖尿病大鼠肾缺血再灌注组(ND+I/R);④糖尿病大鼠肾缺血再灌注组(DM+I/R);⑤糖尿病大鼠缺血再灌注+氯喹预处理组(CD+I/R)。于再灌注48小时后处死大鼠,肾脏切片行H&E染色,TUNEL法检测和免疫组化染色。检测血清BUN和Cr水平,检测肾组织 IL-6 和 TNF-α水平。Western blotting 法检测 TLR7,MyD88 和 NF-κB 蛋白表达水平。结果:与非糖尿病组相比,糖尿病大鼠血糖升高,体重下降(P<0.05)。IHC法检测显示TLR7主要集中表达在肾小管,肾小球有轻微表达。与ND+I/R组相比,BUN、Cr、IL-6和TNF-α,肾小管上皮细胞凋亡率,肾脏组织TLR7,MyD88和NF-κB蛋白表达,在以上指标中,DM+I/R组显著升高(P<0.05)。所有这些变化通过氯喹抑制TLR7后进一步降低(P<0.05)。结论:糖尿病可加重大鼠的急性缺血性肾损伤,抑制肾脏TLR7表达可以保护糖尿病肾缺血再灌注损伤,其机制可能为通过抑制TLR7活化,下调TLR7/MyD88/NF-κB信号转导通路,从而降低肾脏炎性反应水平和减轻细胞凋亡。第二部分 TLR7在人肾小管上皮细胞高糖缺氧复氧损伤中的作用机制研究目的:研究TLR7在HK-2细胞高糖缺氧复氧下损伤的变化及作用机制。方法:随机将HK-2细胞分为8组(n=6):①低糖组(LG组);②高糖组(HG组);③低糖+甘露醇组(M组);④低糖缺氧复氧组(LH/R组);⑤高糖缺氧复氧组(HH/R组);⑥高糖+缺氧复氧+TLR7沉默组(HH/R-siRNA组);⑦高糖+缺氧复氧+RNA干扰对照组(HH/R-scrambled siRNA组);⑧高糖+缺氧复氧+氯喹预处理组(HH/R-CQ组)。采用先高糖刺激72h,紧接着缺氧4h复氧2h的方法,建立人肾小管上皮细胞的高糖缺氧复氧模型,分别检测CCK-8和LDH判断细胞活性和受损程度,ELISA法检测细胞内IL-6和TNF-α水平改变。流式细胞仪法检测细胞凋亡率。采用免疫荧光和Western blotting法检测肾脏细胞TLR7,MyD88和NF-κB蛋白的表达。结果:与低糖组相比,高糖组细胞活性下降,LDH、IL-6、TNF-α、细胞凋亡率、免疫荧光表达、TLR7蛋白,MyD88蛋白及NF-κB蛋白表达增多(P<0.05)。与LH/R组相比,HH/R组细胞活性下降,LDH、IL-6、TNF-α、细胞凋亡率、免疫荧光表达、TLR7蛋白,MyD88蛋白及NF-κB蛋白表达增多(P<0.05)。与HH/R组相比,HK-2细胞TLR7 si-RNA组和氯喹预处理组细胞活性上升,LDH、IL-6、TNF-α、细胞凋亡率、免疫荧光表达、TLR7蛋白,MyD88蛋白及NF-κB蛋白表达下降(P<0.05)。结论:在HK-2细胞高糖缺氧复氧损伤中,抑制TLR7可减轻高糖缺氧复氧对细胞的损伤。