背景 多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是高致残性的白质炎性脱髓鞘病变为表现的中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病,并伴有免疫反应及轴突损伤,其中青壮年发病率较高并且难以治愈。在我国,近年多发性硬化的发病率呈现上升的趋势,尤其随着临床上对该病的认识逐渐深入,近年来确诊人数明显增多。由于多发性硬化属于慢性进行性疾病,在严重影响患者生存质量的同时也加重了家庭和社会的经济负担。目前对于多发性硬化的研究较多,但其具体发病机制仍不完全清楚,可能与自身免疫反应、病毒的感染、个体遗传的因素、患者的生存环境等多方面因素有关。临床上多应用免疫抑制药或免疫调节药物治疗,可对其临床症状有明显的缓解效果。多发性硬化被认为是由免疫细胞引起的炎症所致的神经细胞轴突损伤,在疾病进程的不同阶段,神经损伤所呈现的方式有所不同,组织损伤和感染时引起的炎症反应是机体通过免疫细胞及其分泌炎性因子产生的防御和修复进程。但过度活化的免疫细胞介导的炎症反应将在中枢神经系统中引起神经细胞的脱髓鞘反应。因此,当免疫细胞被活化时,适度地控制炎症反应水平,有助于抑制其对自身细胞的攻击所造成的损伤。雷帕霉素通过抑制m TOR信号通路诱导自噬,非特异性的抑制免疫细胞的过度活化,降低神经组织的炎症反应,MCC950(CP-456773)可通过抑制NLRP3炎症小体的构建减少炎症因子的表达。因此,雷帕霉素和MCC950均有望通过抑制免疫细胞的过度活化减轻神经细胞的损伤,缓解多发性硬化的临床症状。对于多发性硬化的免疫治疗通常采用全身用药,而肠道内淋巴组织中储藏的免疫细胞超过机体总数70%,因此免疫抑制剂的作用效果也将累及肠道内免疫系统活性。肠道内淋巴组织联合黏膜层共同组成机体免疫的第一道防线,具有黏膜屏障作用,是外来病原体及抗原物质侵入和定植的主要场所。中枢及肠道免疫系统、肠道菌群、各层次神经系统和相关内分泌系统等几部分相互之间形成作用网络,组成脑肠菌轴(Brain gut enteric microbiota axis,BGMA)。各层次神经系统对肠道进行调控,使肠道菌群与脑之间通过脑肠轴形成双向调控,促使肠道内效应细胞激活并释放信号分子,并调控肠腔内菌群生长、组成及粘附定植。消化道作为体内最大的免疫组织,在病理状态下,当肠黏膜屏障受到损伤,肠道内的微生态的稳定受到破坏,可导致肠道菌群失调,并通过脑肠轴途径影响脑和肠组织的免疫细胞活性,同时促进神经系统疾病的进程。在多发性硬化发病的同时,由于体内免疫平衡被打破,中枢神经系统受到损伤,受其调控的各级神经冲动传导也不同程度的损伤或抑制,从而引起肢体瘫痪等明显的临床症状。肠道内的免疫系统活化程度受到影响,可导致肠道黏膜组织的通透性及微生物附着方式发生变化,加剧疾病的进程。因此,本课题提出假说:通过雷帕霉素和MCC950等免疫抑制剂的治疗,可抑制脑和肠道中免疫细胞的过度活化,降低其对神经细胞髓鞘结构的损伤作用,以恢复肠黏膜的免疫屏障作用及肠道内的微生态平衡,因此免疫抑制剂的作用有助于提高疾病的治疗效果,减缓疾病的进程。目的 本课题通过多肽免疫的方法制备自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型,基于脑肠菌轴(BGMA)理论,采用免疫抑制剂雷帕霉素和MCC950分别/联合治疗模型小鼠,分别从脑、肠免疫屏障和肠道菌群三个方面系统探讨多发性硬化的发病机制及免疫抑制剂的治疗策略。通过检测脑和肠黏膜内的免疫反应相关细胞的增殖和作用方式、肠道菌群的多样性和丰度的改变,及其与多发性硬化疾病表现之间的关系,探讨雷帕霉素和MCC950在疾病发生发展的不同阶段中的治疗效果及作用机制。通过验证脑部疾病与肠道菌群是否存在关联,为研究多发性硬化的发病机制和治疗方法提供新思路。方法 本课题采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)的主要抗原决定簇之一MOG35-55作为抗原,通过皮下注射的免疫C57BL/6小鼠制备实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)动物模型。自小鼠接受免疫第3天开始,使用雷帕霉素和MCC950分别/联合进行早期治疗。1.药物治疗组为分别每隔一天腹腔注射雷帕霉素和/或MCC950,对照组和模型组每隔一天腹腔注射PBS缓冲液代替药物治疗,自免疫次日开始观察小鼠神经功能评分并称量体质量。2.分别于免疫后第8天、16天、24天,将小鼠麻醉灌注处死,并收集小鼠脾脏、盲肠、大肠及脑等组织样本,通过组织病理学检测确定疾病进程及药物治疗效果;分别检测m TOR/NLRP3相关信号通路的变化,及CD4、CD8和GFAP等相关免疫标识物的表达变化,探讨雷帕霉素和MCC950药物治疗的机制。3.收集各组小鼠粪便样品,提取菌群基因组DNA,经通用引物扩增将各组肠道菌群的16S r RNA V4可变区经过PCR扩增,并将经过电泳检测及回收纯化扩增的产物,用于Illumina-Misq高通量测序平台进行测序,使用QIIME软件进行聚类分析并在数据库Silva比对,检测对照组和雷帕霉素和/或MCC950处理组中微生物的数量和构成改变。4.通过生物信息学分析,计算肠道菌群的Alpha多样性指数,比较各组中微生物的丰度和多样性,Beta多样性分析比较不同样品间物种多样性的差异;通过LEf Se差异分析、各样本物种进化树分布分析、物种的系统发育及功能预测等分析,探讨疾病进展过程中,雷帕霉素和/或MCC950治疗引起的免疫细胞活性的抑制与肠道菌群变化的关联。结果 1.经过MOG35-55免疫的C57BL/6小鼠在免疫7d左右开始陆续发病,并出现明显的疾病症状,并逐渐出现尾部无力,肢体瘫痪等。在发病高峰期之后陆续自愈,但体重普遍减轻。经过雷帕霉素和MCC950分别/联合治疗之后,小鼠的发病高峰期推迟,而自愈期提前,但联合用药组小鼠体重减轻明显。2.雷帕霉素作为免疫抑制剂通过抑制m TOR通路信号激活细胞自噬作用以减轻 EAE小鼠临床症状。MCC950可通过抑制NLRP3炎症小体的组装,抑制EAE小鼠体内IL-1β等炎症因子对EAE小鼠脑组织的损伤作用。通过分别检测小鼠发病初期、高峰期及恢复期的脑组织,经过雷帕霉素霉素和MCC950治疗之后,小鼠的发病期缩短,疾病症状减轻,CD4、CD8和GFAP的表达量降低。3.模型小鼠的脑组织和肠黏膜中可见炎症细胞浸润,并且可见肠壁增厚,脾脏肿大,以上现象均为自身免疫反应造成。在EAE模型中可检测到脑和肠黏膜CD4+T和CD8+T淋巴细胞增加,参与肠道黏膜免疫调节作用。4.小鼠经造模及药物治疗结束后,分别收集各组粪便,提取菌群DNA,样品经过处理之后,在Illumina-Misq高通量测序平台进行测序,使用QIIME软件进行数据处理并聚类分析,在Silva数据库中进行分析比对,进而统计微生物的组成及比例。与对照组相比,经过MOG35-55免疫造模之后,模型组的菌群OTU总数降低,经过雷帕霉素或MCC950治疗后,OTU总数有所增加。两种药物联用治疗后,OTU增加总数明显高于药物单独治疗组。5.小鼠粪便中主要菌种为拟杆菌门(Bacteroidetes,63.31%)、厚壁菌门(Firmicutes,24.11%)及变形菌门(Proteobacteria,9.1%),与对照组相比,模型组中拟杆菌门比例显著下降,而厚壁菌门和变形菌门比例升高。6.分别分析小鼠粪便中微生物群落中的Alpha多样性和Beta多样性。通过Alpha多样性分析,模型组与对照组在物种多样性方面不具有明显差异,对照组中菌群丰度高于模型组,而药物治疗组的物种丰度介于两者之间。7.通过Beta多样性分析,发现对照组和雷帕霉素治疗组的物种组成比例相对其他组差别较明显,对照组中主要标志菌群为拟杆菌纲(Bacteroidia)等,模型组中标志菌群为拟杆菌属(Bacteroides)等,雷帕霉素治疗组中标志菌群为厚壁菌门(Firmicutes)等,MCC950治疗组中标志菌群为克里斯滕森菌科(Christensenellaceae),联合治疗组中标志菌群为艾克曼菌属(Akkermansia)等。结论 1.在EAE小鼠的早期治疗中使用雷帕霉素、MCC950等免疫抑制剂可以有效延缓病情进展,可减轻EAE小鼠的临床症状,雷帕霉素和MCC950可分别通过抑制mTOR信号通路和NLRP3炎症小体的组装,抑制脑组织和肠道中的免疫炎症反应,从而缓解疾病的进程,并可抑制脑组织及肠道中免疫细胞的过度激活。2.EAE小鼠模型制备过程中,脑和肠黏膜内的免疫细胞被激活,使肠道内微环境发生变化,肠道菌群的丰度降低。免疫抑制剂雷帕霉素和MCC950的早期治疗,通过降低组织内免疫细胞活性,修复肠黏膜免疫屏障,使肠道菌群的组成结构有所恢复。