研究背景:根据世界卫生组织统计,目前全球约有2.48亿慢性乙型肝炎感染患者,每年大约超过65万人死于如肝功能衰竭、肝硬化及肝细胞癌等HBV相关终末期肝病。多年来,随着HBV疫苗联合乙型肝炎免疫球蛋白的母婴阻断措施的普及,高效抗病毒药物的广泛运用,乙肝流行率降至8%以下,但是我国仍然是病毒性肝炎的高流行区,攻克乙肝,降低乙肝流行率是临床及科研工作者仍应努力的方向。目前,各大临床实践指南均推荐功能性治愈或临床治愈为理想的治疗终点(定义为HBsAg清除,伴或不伴抗-HBs血清学转换)。核苷(酸)类似物(Nucleos(t)ide Analogues,NA)是指南推荐慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗药物之一,如替诺福韦(TDF)、恩替卡韦(ETV)及替诺福韦艾拉酚胺(TAF)被推荐为一线治疗药物,NA能有效抑制HBVDNA复制,延缓疾病进展。但是,在临床上,患者的依从性、育龄期患者备孕相关问题以及患者经济负担等使得停用NA治疗CHB成为一部分患者的需求。国际各大指南推荐的停药意见不一。欧洲肝病协会及美国肝病研究协会推荐乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)发生血清学转换后可以考虑停药。然而,多数患者只能获得完全应答。出现这种情况,是由于核苷(酸)类似物难以清除乙肝患者肝内ccc DNA,尽管患者经过长期NA类似物治疗达到停药标准后,肝内残留的ccc DNA使得HBVDNA得以恢复复制,大量停药相关研究表明,长期NA治疗停药后复发率高。最近一篇柳叶刀子刊报道,长期NA治疗停药后存在发生肝炎的风险。为了实现安全停药,研究者极力探索与NA停药后临床复发的相关因素,迄今为止,预测停药后临床复发的因素大致可分为与HBV相关指标以及宿主相关指标,与HBV相关的指标有:血清HBsAg水平、HBeAg血清转换时HBV DNA水平、共价闭合环状 DNA(Covalently closed circular DNA,cccDNA)水平、乙型肝炎核心相关抗原(Hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)水平、Anti-HBc水平以及HBV pgRNA水平、HBV基因型等。与宿主相关的指标有:年龄、NA治疗后患者获得应答的时间、NA巩固治疗时间、NA治疗的总时间、宿主遗传背景SNP突变、宿主免疫相关指标CXCL13、IFN-γ、IL-8、PD-1+CD8+HBV特异性T细胞等。尽管目前探索指标众多,但是目前尚缺乏简便有效的免疫学相关指标来反映NA停药后临床复发及免疫学状态。ST2蛋白是白细胞介素1(Interleukin-1,IL-1)受体超家族的成员,常表现为血清可溶性 ST2 蛋白(Soluble growth stimulation expressed gene 2,sST2)和跨膜性ST2蛋白(ST2L)两种形式。近年来的研究表明,sST2作为一种“警报物”在多种疾病中发挥预测作用,如冠心病心力衰竭、哮喘、炎症相关性疾病、神经性疾病和乙型肝炎病毒相关性肝衰竭等。Huan等研究表明,不同病程的慢性乙型肝炎病毒感染时血清白细胞介素-33(Interleukin-33,IL-33)和sST2水平不同。随着CHB患者血清ALT水平升高,血清IL-33和sST2水平升高。说明IL-33和sST2与CHB患者的肝损伤相关。Wang等研究显示CHB患者的血清sST2水平显着高于健康对照组。ADV治疗12周后,sST2水平无明显变化。Wang M等证实了血清sST2水平在重度酒精性肝炎患者中表达上调。然而,血清sST2在慢性乙型肝炎抗病毒治疗停药后是否能作为一种提示临床复发的指标仍待进一步研究。研究目的:本研究通过随访并监测入组患者的血清病毒学、生化学指标以及血清中sST2水平,观察sST2在停药后的动态变化过程,判断sST2是否作为一种早期“警报物”提示停药患者停药后临床复发,减少停药后发生临床复发所带来的肝损伤等风险提供相关研究理论基础。研究对象及方法:1、实验设计及研究对象本研究是一项前瞻性、单中心、观察性队列研究,入组患者均为代偿期无肝硬化亚洲CHB患者(血清HBsAg阳性持续6个月以上),患者自愿并知情同意后入组CON队列进行随访。纳入患者来自南方医科大学南方医院感染内科门诊或住院患者,入组患者停药时间至少达到6个月以上。患者根据2012年APASL指南停止NA治疗,原则如下:对于HBeAg阳性患者,口服NA治疗达完全应答(HBVDNA达检测线以下、ALT复常、HBeAg发生血清学转换)后,巩固治疗至少12个月;对于HBeAg阴性患者,抗病毒治疗达完全应答(HBV DNA达检测线以下、HBeAg血清学转换、ALT复常)后,巩固治疗至少18个月。入组患者具体标准如下:1.年龄≥18岁;2.对于治疗前HBeAg阳性患者,口服NA治疗至HBVDNA达检测线以下、ALT复常、HBeAg发生血清转换后巩固治疗至少12个月;3.对于HBeAg阴性患者,抗病毒治疗至HBV DNA达检测线以下、HBeAg发生血清学转换、ALT复常后,继续巩固治疗至少18个月;3.停药前HBV DNA经Cobas TaqMan法检测低于检测下线(Lower Limit of Detection,LLOD,HBV DNA<20IU/mL);4.治疗前患者处于代偿期、无肝硬化病史。排除标准如下:1.治疗前有肝功能失代偿病史(如腹水、食管-胃底静脉曲张破裂出血或肝性脑病等),影像学检查发现可疑结节或血清甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)>20ng/mL;2.停药前肝穿活检提示患者有明显的肝纤维化,肝纤维化扫描提示明显的肝纤维化或肝硬化;3.排除HCV、HDV、HIV、肝吸虫、肝包虫等感染;4.排除其它肝脏疾病(如自身免疫性肝病、酒精性肝病、脂肪肝、肝豆状核变性及肝内寄生虫感染等);5.排除其它严重的或活动性疾病,如泌尿系统、循环系统、呼吸系统、代谢性疾病、免疫缺陷疾病或癌症等;6.排除肝移植后或计划进行肝移植的患者。本临床研究经南方医科大学南方医院伦理委员会审批进行(NFEC-201209-K3)。本项研究已经在世界卫生组织国际临床试验注册平台注册(注册号:ChiCTR-ONRC-12002315)。入组患者均充分知情同意并书面签署知情同意书。2、随访入组患者检测停药时(EOT)、停药后4W、12W、24W、48W等随访时间点的生化指标、病毒学指标以及血清sST2的表达。其中生化指标:ALT水平,病毒学指标:HBsAg水平、治疗前HBeAg状态、anti-HBe状态、HBV DNA定量以及Anti-HBc水平。3、终点,再治疗标准及定义本次临床试验的主要临床终点是临床复发(Clinical relapse,CR),定义为:HBV DNA>2000IU/mL同时伴ALT>2ULN。病毒学复发定义为:HBV DNA>2000IU/mL。为在本研究中,截止至停药后48周,发生临床复发的患者定义为CR(Clinical relapse,CR)组,发生病毒学复发以及维持持续应答的患者定义为NCR(None clinical relapse,NCR)组。对于临床复发患者,退出本次研究,重新开始抗病毒治疗。次要临床试验终点:肝脏超声或肝纤维化扫描检测证明出现了肝硬化。4、实验室检测生化学检测:ALT采用Olympus AU5400全自动生化分析仪分析检测,男性和女性ALT的ULN分别为40IU/L和35IU/L。病毒学检测:治疗前HBV DNA定量采用国产PCR试剂检测,检测下限(Lower Limit of Detection,LLOD)为 1000copies/ml。HBeAg、HBsAg 定量采用ARCHITECT检测。HBV DNA定量检测采用Cobas荧光定量PCR法检测,检测下线为20IU/mL。Anti-HBc采用双夹心免疫分析法(Wantai,Beijing,China),检测下限为0.1IU/mL。5、酶联免疫吸附反应(ELISA)所有受试者采清晨空腹血30mL,其中抗凝血20mL,离心后收集血清存放于-80℃。根据说明书利用 ELISA(Human ST2/IL-33 R DuoSet ELISA Kit,USA,DY523B-05)检测血清中sST2水平。6、统计学方法所有数据采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0进行处理及构图。计量资料以均数±标准差或中位数(最小值-最大值)表示。计数资料采用列联表卡方检验;两组间计量资料采用两独立样本t检验,不满足正态分布采用两独立样本秩和检验(Mann-Whitney U test)。两组间计数资料采用Chi-square检验。配对-t检验及重复测量方差分析(Repeated measures ANOVA)事后Bonfreroni test用于基线及其他时间点之间差异的比较。COX比例风险回归模型,用于确定停止长期NA治疗后临床复发相关的因素。相关性分析采用Pearson等级相关系数表示。所有统计学分析基于双侧假设检验,P<0.05具有统计学意义。研究结果:1、人口学数据及临床特点在2012年12月到2018年5月之间,我们纳入91例患者进入本次前瞻性研究当中。所有患者均满足了停药标准并且签订了停药协议,同时停药时间至少6个月。在91例患者中,男性75例,女性16例。其中,一线治疗患者39例。91患者中平均年龄35.7±7.9,抗病毒治疗时间中位数56.7±26.2个月,巩固治疗时间中位数28个月(最大值-最小值18-46个月),ALT水平为0.5×ULN,HBVDNA水平低于检测下线。在开始治疗时,HBeAg阳性患者61例,HBeAg阴性30例。2、NA停药后的临床复发和病毒学复发本研究纳入91例符合2012年APASL停药指南CHB患者随访至240W。临床复发及病毒学复发多数发生在48W以内,累积病毒学复发率为80.16%,累积临床复发率为48.86%,与相关文献报道一致。病毒学复发率高,且病毒学复发率高于临床复发率。3、CON研究队列患者血清中sST2水平的动态变化研究纳入了 CON队列患者中,我们观察了 91例长期NA停药后CHB患者血清中sST2的表达的动态变化,根据停药时的ALT及HBVDNA水平,我们分为CR组26例和NCR组65例。CR组患者年龄大于NCR组(p=0.039),治疗结束时HBsAg水平相对较高(p=0.071)。治疗前HBeAg状态,ALT和HBV DNA水平在CR和NCR组之间无显着差异(表2)。停止治疗后,CR组的HBV DNA水平增加24周,并在24-48周内略有下降。在NCR组中,HBV DNA水平具有相同的趋势,但在每个时间点都低于CR组(图2A)。CR组第24周和第48周的ALT水平显着高于NCR组(图2B)。这些结果表明,大多数患者在NA停药后较早出现临床复发。我们在NA停药后第0周,第4周,第12周,第24周和第48周进一步分析了 CR组和NCR组的血清sST2水平。CR组在基线和第4周两组之间没有显着差异,在第12周,第24周和第48周表达比NCR组更高的sST2水平(图2C)。与基线相比,CR组临床复发时间点sST2表达增加(p<0.001),而NCR组基线与48W sST2之间无显着差异(图2D)。4、血清中sST2的表达与基线HBsAg水平、ALT水平、HBV DNA定量、Anti-HBc水平呈正相关关系我们采用统计学方法评估了血清中sST2的表达与基线HBsAg水平、ALT水平、HBV DNA定量、Anti-HBc水平的相关关系,Pearson相关关系分析得出,长期NA治疗慢性乙型病毒性肝炎患者停药后血清中sST2的表达与HBsAg(P<0.0001)、ALT(P<0.0001)、HBV DNA(P<0.0001)、Anti-HBc(P<0.0001)呈正相关关系。5、基线sST2不是预测NA停药后临床复发的独立危险因素为了阐明治疗结束时血清sST2水平是否与临床复发相关,我们进行了单变量和多变量COX回归分析。结果显示:年龄>35 y(P=0.006;风险比HR:2.647,95%可信区间 CI:1.324-5.291),HBsAg>200 IU/ml(vs≤200IU/ml)(P=0.006;HR:3.697,95%CI:1.447-9.444),HBV DNA 水平升高>20000 IU/ml(vs≤20000IU/ml)(P=0.017;HR:2.531,95%CI:1.179-5.435)以及 12WsST2水平(P<0.001;HR:4.655,95%CI:2.345-9.243)是临床复发的独立预测因子。然而,基线血清sST2表达不能作为停药后临床复发的独立预测因子。研究结论:1、在本前瞻性研究中,共有91例患者,共有57例发生病毒学复发,26例发生临床复发,累积病毒学复发率为80.16%,累积临床复发率为48.86%。停药后的病毒学复发比临床复发率高,这与相关文献报道一致。本研究发现,长期NA停药后患者发生临床复发及病毒学复发多数在停药后48W以内。2、我们对比了 CR组与NCR组两组之间的差异,结果发现:基线CR组及NCR组两组间年龄差异具有统计学意义(p=0.039),ALT水平(p=0.385)、HBV DNA定量(p=0.071)、血清Anti-HBc水平(p=0.245)两组间无统计学差异。治疗前HBeAg状态,ALT水平和HBV DNA水平在CR和NCR组之间无显着差异(表2)。说明除了 sST2之外,年龄可能是影响临床复发的混杂因素。3、我们分析了停止长期NA治疗后血清sST2水平,HBV DNA水平,ALT水平的动态变化。CR组0-24周有HBV DNA升高趋势,24-48周有轻微下降趋势;NCR组具有类似的趋势,但幅度小于CR组;说明停药后HBVDNA均升高,且CR组高于NCR组。CR组在停药后12周开始有ALT水平波动,在停药后24周、48周ALT水平显著高于NCR组。sST2与ALIT有相类似的波动趋势,但是幅度小于ALT水平的波动。4、本研究通过测定患者停药后血清sST2水平,分析血清中sST2水平与HBsAg、HBVDNA以及ALT水平的相关关系,结果发现,血清中sST2与HBsAg、HBV DNA以及ALT呈现正相关关系。5、通过COX回归分析可以总结出,年龄、HBV DNA水平、HBsAg水平及12WsST2水平是预测停药后临床复发的独立危险因素。但是,我们未能发现sST2可以作为预测停药后复发的独立危险因素。6、血清中的sST2是一种炎症细胞因子,在免疫应答后被激活,可能在长期NA治疗结束后发挥免疫调节作用。但是,这一现象背后的具体机制还有待于今后的探索。