论文部分内容阅读
尽管目前牛羊等家畜胚胎冷冻保存技术已成功应用于商业和生产实践,但鱼类胚胎冷冻后能够存活的报道却极少,且实验结果不能被重复。可见,成功冷冻保存鱼类胚胎是当前的一个世界性难题。鱼类胚胎成功保存的难点:一是胚胎发育对温度变化极为敏感;二是胚胎内水分与抗冻保护剂的交换速度慢,这与鱼类胚胎体积大、含水丰富、膜通透性差等独特的细胞结构特点有关。因此,获得温度对鱼类胚胎发育能力影响的基础数据,以及筛选出一种高渗、低毒的冷冻液,将有助于提高鱼类胚胎的冷冻保存效果。为此,本文以模式动物青鳉作为实验材料,开展了青鳉胚胎发育规律观察和温度对青鳉胚胎发育能力影响的研究,建立起青鳉胚胎培养发育技术平台;在此基础上,比较了两种玻璃化冷冻液(EFS40和EFS60)对青鳉胚胎的毒性作用,并尝试了采用电子显微镜铜网法和细管法冷冻保存青鳉胚胎,结果如下:1.通过利用Olympus显微镜对青鳉胚胎发育过程连续观察,以及利用显微镜成像系统记录胚胎发育过程并进行分析,结果表明:青鳉胚胎发育(从受精到出膜)可大致可分为卵裂、囊胚形成、原肠胚形成,神经胚形成、器官形成和孵化出膜共六个阶段,整个发育过程可细分为39个明显的时期,在26℃条件下青鳉受精卵需要历时9d完成整个胚胎发育过程,并孵化出膜。2.研究水温变化对青鳉胚胎发育影响的结果表明:在19.69℃～36.03℃范围内,青鳉胚胎都能孵化出仔鱼,孵化过程随水温上升而缩短;其中26.03℃～33.90℃是胚胎发育的适宜温度;在27.58℃孵化率最高,达到83%、仔鱼成活率达到90.9%;当水温低于17.64℃,青鳉胚胎发育极其缓慢,至47d只有1尾仔鱼孵出,孵化率为1%;当水温高于38.67℃,其胚胎不能孵出仔鱼。3.以青鳉受精卵为实验材料,研究了2种冷冻液(EFS40和EFS60)对五个不同发育期胚胎的毒性作用,结果表明:青鳉的囊胚期胚胎对EFS40和EFS60的毒性耐受力最差,在EFS40和EFS60中处理10min后的成活率分别为27.04%和24.07%,孵化率分别为13.70%和14.07%,与对照组成活率(96.67%)与孵化率(93.33%)差异极显著(P<0.01);6肌节、16肌节和24肌节胚胎对EFS40和EFS60的耐受力依次增强,以发眼期胚胎的耐受力最强,其胚胎在EFS40中进行毒性处理30min后的成活率仍可达93.33%,孵化率达77.27%,发眼期胚胎在EFS60中毒性处理20min的成活率为75.93%,孵化率70.60%;各时期青鳉胚胎的成活率和孵化率,均随着在冷液中进行毒性处理时间的延长而逐步降低,EFS60对青鳉胚胎的毒性高于EFS40。4.以EFS40和EFS60作为冷冻液,比较细管法和铜网法冷冻保存青鳉发眼期胚胎效果的试验结果表明:用EFS40冷冻保存青鳉发眼期胚胎时,冷冻和解冻过程中均出现冰晶,而EFS60无冰晶出现;EFS40解冻后胚胎的完整率显著低于EFS60(P<0.01);铜网法解冻后胚胎的形态完整率显著高于细管法(P<0.01);但所有冷冻组解冻后的胚胎成活率均为0。