论文部分内容阅读
目前,全球近22亿人超重,约占全球总人口的1/3,其中肥胖人群占10%。而我国肥胖人数已达9500万,高居全球第一。肥胖是引起心血管疾病、2型糖尿病和肿瘤等疾病的高危因素,防治肥胖是公共健康领域的重要议题。白色脂肪细胞的异常增多和堆积是肥胖的重要表征。研究表明,冷刺激、肾上腺素受体激活可刺激白色脂肪棕色化。白色脂肪棕色化,将机体储存的能量通过解偶联蛋白(Uncoupling protein 1,UCP1)解偶联的方式释放热量,增加机体能量代谢。因此,深入研究白色脂肪棕色化的分子机制,为抵抗肥胖及相关代谢疾病提供新思路。肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,其调控AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine monophosphate(AMP)activated protein kinase,AMPK)家族的磷酸化,参与细胞代谢、增殖、分化和肿瘤的发生,但LKB1调控白色脂肪棕色化的作用尚未明确。本研究前期发现食源性肥胖大鼠下丘脑内LKB1/AMPK信号通路受损。下丘脑是调节能量代谢的高级中枢,也可调节外周脂肪的生成。因此,本研究拟通过中枢和外周两方面探讨LKB1对白色脂肪棕色化的作用及其机制。方法:1.构建并合成LKB1腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并对Sprague-Dawley(SD)大鼠进行第三脑室注射。注射后恢复一周,给予标准饲料(chow fat,CF)或高脂饲料(high fat,HF)喂养,将大鼠随机分为四组,即CF-AAV组:标准饲料喂养,脑室内注射AAV;HF-AAV组:高脂饲料喂养,脑室内注射AAV;HF-LKB1-L组:高脂饲料喂养,脑室内注射低滴度的LKB1-AAV;HF-LKB1-H组:高脂饲料喂养,脑室内注射高滴度的LKB1-AAV。每天监测进食量的变化,每周检测体重的改变。2.高脂干预9周后,双能X线骨密度仪检测体脂含量变化。处死取材,观察下丘脑内LKB1 AAV荧光表达情况;Western Blot法检测下丘脑内LKB1/AMPK信号通路蛋白水平的表达;HE染色观察白色脂肪细胞形态的变化;通过对脂肪细胞DNA检测观察脂肪细胞数量的改变;油红O染色观察肝脏组织内脂质堆积情况;观察SD大鼠肩胛间区棕色脂肪是否存在及质量改变;分析血脂代谢的变化;RT-PCR法检测脂肪生成因子、脂肪分解基因、及脂肪酸氧化因子的mRNA表达;Western Blot法检测白色脂肪组织内棕色脂肪标志蛋白UCP1的表达;免疫组织化学染色观察下丘脑内NPY和POMC神经肽表达变化及通过RT-PCR检测mRNA水平表达;Western Blot法检测下丘脑内黑皮素受体MC3R/MC4R蛋白水平表达情况;ELISA检测血清内肾上腺素的含量变化,进一步探讨下丘脑过表达LKB1调控食源性肥胖的作用机制。3.通过构建过表达或沉默LKB1的3T3-L1单克隆细胞系,给予棕色化诱导液诱导分化为米色脂肪细胞。首先,MTT法检测LKB1的表达对3T3-L1细胞增殖的影响;油红O染色观察LKB1表达对3T3-L1细胞分化形态的影响及脂滴生成的情况;检测脂质含量的改变;免疫荧光法检测分化成熟后的细胞内UCP1的表达情况;RT-PCR法检测棕色脂肪特异性基因,米色脂肪标志基因,脂肪生成相关基因、脂肪分解基因及脂肪酸氧化因子的mRNA表达;Western Blot检测棕色脂肪特异性基因,脂肪生成因子和LKB1/AMPK信号通路分子的蛋白水平表达,探讨LKB1对3T3-L1脂肪前体细胞棕色化的作用及机制。结果:1.下丘脑内过表达LKB1 AAV组大鼠摄食量减少,降低体脂含量及体重。2.高脂饮食可显著增加血液中胆固醇、低密度脂蛋白的含量,降低高密度脂蛋白的含量。中枢过表达LKB1可降低胆固醇和低密度脂蛋白的含量,提高高密度脂蛋白,提示下丘脑过表达LKB1可改善高脂引起的血脂代谢紊乱。3.高脂饮食可促使脂肪细胞体积增大,数量减少。而下丘脑过表达LKB1后脂肪细胞的体积变小,数量增多;另外,白色脂肪组织内UCP1蛋白表达上调,提示白色脂肪发生棕色样变。肝脏组织油红O染色表明,中枢干预LKB1组肝脏细胞内的脂滴减少,肝脂肪变性减轻。其次,中枢过表达LKB1可促进肩胛间区棕色脂肪生成。4.下丘脑过表达LKB1可促进POMC表达,抑制NPY表达。ELISA检测发现血清肾上腺素含量增多,提示交感神经活性增强。Western Blot结果表明,中枢过表达LKB1激活下丘脑AMPK活性,增强POMC神经元功能,进而可能激活下丘脑AMPK-POMC-交感神经轴,从而抑制肥胖的形成。5.LKB1过表达或沉默均不影响3T3-L1脂肪前体细胞的增殖率;过表达LKB1可促进3T3-L1脂肪前体分化为多房的小脂滴,并且棕色脂肪特异性基因UCP1表达上调,米色脂肪特异性基因(Tmem 26和CD137)表达上调,提示发生棕色样变。沉默LKB1后3T3-L1脂肪前体细胞分化单房的大脂滴,且棕色脂肪特异性基因表达下调,米色脂肪特异性基因也下调。6.Western Blot发现过表达LKB1可促进PPARγ表达,而沉默LKB1表达可抑制PPARγ的表达。PPARγ在脂肪代谢中起至关重要的作用。因此,为验证LKB1调控3T3-L1细胞棕色化的作用,在过表达LKB1的细胞系内加入PPARγ拮抗剂GW9662,观察LKB1对棕色化作用的改变。通过过表达和沉默LKB1表达从正反两反面验证LKB1可能是通过调节PPARγ的表达来促进白色脂肪棕色化。结论:1.中枢过表达LKB1可能通过激活下丘脑内AMPK-POMC-SNS轴,促进白色脂肪棕色化,增加机体能量消耗,进而抑制白色脂肪生成,降低体重,抑制食源性肥胖的发生。2.LKB1可促进3T3-L1脂肪前体细胞棕色化,且可能通过调控PPARγ的表达来促进白色脂肪棕色化。