论文部分内容阅读
目的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染呈全球性流行发展,是欧美及日本等国家终未期肝脏疾病的主要原因之一。目前,全球HCV的感染率约为3%,大约1.7亿人感染HCV,每年新发丙型肝炎病例达到3.5万例。我国HCV感染率为1.5～3.5%,总体感染人群3000万以上。HCV感染后约80%成为慢性持续状态,慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化,甚至可发展为肝硬化及肝细胞癌,对患者的健康和生命危害非常大,已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A作为重要的非结构蛋白,近年来有关它的研究倍受关注,它具有抗凋亡、转录激活作用、干扰细胞内信号转导通路、调解病毒复制水平等多项生物学活性,提示其在干扰素疗效预测、病毒复制、细胞凋亡、肝细胞癌发生等多方面均具有重要作用。目前关于TLRs与机体相互作用的机制成为研究热点之一,其中Toll样受体3(TLR3)主要表达于树突状细胞,能够识别病毒的dsRNA,在抗病毒过程中发挥了重要作用。TLR4是最早发现的哺乳动物TLRs蛋白,机体多种细胞表面均能表达TLR4,它被认为与革兰氏阴性细菌及其内毒素的识别和激活有关。它们在肝脏疾病包括酒精性肝病、病毒性肝炎、肝纤维化等的发生、发展过程中发挥重要作用。在本研究中,我们通过转染HCV NS5A蛋白表达质粒观察HCV NS5A蛋白对肝细胞内TLR3及TLR4 mRNA和蛋白表达的影响,为丙型肝炎的发病机制积累实验依据,并对丙型肝炎的治疗提供理论依据。方法1.质粒转染：将QSG7701细胞种植于六孔板,待细胞融合60-70%时,按照说明书中的转染程序,分别将pcNS5A和pRc/CMV质粒转染入细胞,12小时后换含10%胎牛血清的DMEM培养基,转染48小时后收集细胞进行接下来的实验。2.免疫细胞化学染色：用免疫细胞化学染色的方法检测TLR4蛋白质及NS5A蛋白质的表达。3. RT-PCR:按RNA提取试剂盒说明书进行,提取上述转染的7701细胞总RNA,用紫外光分光光度计测定RNA的浓度。取2ugRNA,逆转录为cDNA进行PCR扩增,再用2%琼脂糖凝胶电泳观测TLR3 mRNA及TLR4 mRNA结果并照相。4.间接免疫荧光：用间接免疫荧光的方法检测TLR3及TLR4蛋白质的表达。5. Western blot:用Western blot的方法以β-actin为参照,检测TLR4蛋白质的表达。结果1.转染pcNS5A质粒组的7701细胞内有HCV NS5A蛋白颗粒表达,呈棕黄色颗粒,主要分布在细胞浆中,以胞核周围最为明显,未转染组和转染pRc/CMV质粒组的7701细胞中则无HCV NS5A蛋白表达。2.用免疫细胞化学染色检测TLR4蛋白的表达,结果显示转染pcNS5A质粒组内有TLR4蛋白质表达,呈棕黄色颗粒,分布在细胞膜中,.未转染组和转染pRc/CMV质粒组则无明显TLR4蛋白表达。说明HCV NS5A能够促进TLR4蛋白质的表达。3.用RT-PCR检测TLR3及TLR4 mRNA的表达。结果表明,在GAPDH内参照表达一致情况下,pcNS5A质粒转染组TLR4 mRNA的表达量明显高于空载体组和未转染组,空载体组和未转染组mRNA的表达相似,结果说明HCV NS5A能够激活TLR4 mRNA的转录水平；然而,pcNS5A质粒转染组与空载体组和未转染组TLR3 mRNA的表达量无明显差别,说明HCV NS5A对TLR3mRNA的转录水平至少无上调作用。4.用免疫荧光方法检测TLR3及TLR4蛋白质的表达。结果显示转染pcNS5A质粒组内有TLR4蛋白质表达,呈现绿色荧光颗粒,未转染组和转染pRc/CMV质粒组则无明显TLR4蛋白表达。说明HCV NS5A能够促进TLR4蛋白质的表达。转染pcNS5A质粒组内及未转染组和转染pRc/CMV质粒组的细胞内均无TLR3蛋白颗粒的表达,说明HCV NS5A对TLR3蛋白的表达无上调作用。5.用Western blot检测TLR4蛋白质的表达,以β-actin为内参照。结果显示pcNS5A质粒转染组TLR4蛋白质的表达量明显高于空载体组和未转染组,空载体组和未转染组的表达相似。说明HCV NS5A能够促进TLR4蛋白质的表达。结论1.HCV NS5A表达质粒能够转染至QSG7701细胞中,表达HCV NS5A蛋白。2. HCV NS5A能激活TLR4 mRNA的转录水平。3. HCV NS5A能促进TLR4蛋白质的表达。4. HCV NS5A对TLR3 mRNA的转录水平及TLR3蛋白质的表达均无明显上调作用。