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背景与目的子宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,近年来发病率不断上升。相关诊疗方法取得了快速发展,但患者预后及生活质量仍不容乐观。从分子水平发现新的分子靶点和分子标记物,提高患者生存率,改善预后和治疗效果,实现精准治疗仍是今后需要努力的方向。hMTERF3是一个负性调节基因,在mtDNA的复制、转录和翻译过程发挥调节作用。有研究显示hMTERF3参与了多种肿瘤的发生发展过程,如胰腺癌、胃癌和乳腺癌等。但目前hMTERF3与子宫颈癌的相互作用尚未见报道。本研究旨在利用TCGA数据集、Oncomine和GEPIA数据库分析hMTERF3基因在子宫颈癌中的表达及其临床价值,通过构建及鉴定重组真核表达载体pSi-hMTERF3,进一步研究转染重组真核表达载体pSi-hMTERF3对子宫颈癌HeLa细胞的线粒体DNA拷贝数、线粒体转录水平、线粒体蛋白表达水平及其细胞增殖、细胞凋亡及氧化磷酸化等生物学行为的影响,为进一步研究hMTERF3与子宫颈癌的相互作用提供了理论依据和实验基础。方法基于Oncomine、TCGA数据库和GEPIA数据库检索hMTERF3基因相关信息,分析hMTERF3在宫颈癌中表达情况及预后情况。成功构建得到4个重组干扰质粒,并通过PCR和DNA测序对其进行鉴定;采用Western印迹检测其对hMTERF3蛋白表达水平的情况,荧光定量PCR检测hMTERF3 mRNA表达水平的情况,并筛选出最有效的shRNA干扰质粒。采用半定量PCR检测线粒体DNA拷贝量变化,荧光定量PCR检测线粒体DNA转录水平的影响,Western blot检测干扰hMTERF3基因后线粒体编码蛋白质的翻译水平。采用流式细胞术检测pSi-hMTERF3对细胞凋亡及线粒体ROS的影响,MTT法检测pSi-hMTERF3对细胞生长的影响。结果(1)Oncomine、GEPIA数据库分析均显示:hMTERF3 mRNA在宫颈癌中与正常宫颈组织相比呈现高表达;TCGA数据集分析显示:子宫颈癌患者hMTERF3mRNA表达量与AJCC临床分期、病理分级有显著相关性(P<0.05),与年龄、原发灶浸润深度(T)、区域淋巴结转移情况(N)、远处转移情况(M)和病理类型无显著相关性(P>0.05);单因素分析显示,原发灶浸润深度、区域淋巴结转移情况、远处转移情况、AJCC临床分期均能影响患者的预后(P<0.05)。年龄、病理分级、病理类型和hMTERF3 mRNA表达量与子宫颈癌患者预后无相关性(P>0.05)。COX多因素回归分析,结果提示,只有区域淋巴结转移情况是影响子宫颈癌患者预后的独立因素(P<0.05)。(2)GEPIA数据库基因相关性分析结果显示,宫颈癌组织hMTERF3基因的表达水平与TFAM、TFB1M、TFB2M、MTERF1、MTERF2、TEFM、PTEN基因的表达水平呈显著正相关性(P<0.01,R>0),与FHIT、MTERF4基因的表达水平无关。(3)PCR和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列;细胞转染后通过Western blot检测目的基因表达水平,经过筛选后以pSi-MTERF3-2,pSi-MTERF3-4转染后对hMTERF3基因表达的干扰效果最好。(4)半定量PCR结果表明,干扰hMTERF3基因表达后宫颈癌HeLa细胞线粒体DNA的复制水平升高。(5)荧光定量PCR和半定量PCR结果均表明,干扰hMTERF3基因表达后能提高线粒体DNA的转录水平。(6)Western blot检测结果显示:干扰hMTERF3基因能够降低线粒体编码蛋白质的翻译水平。(7)流式细胞术检测了pSi-MTERF3对线粒体ROS的影响,结果显示干扰hMTERF3基因表达后,线粒体ROS水平显著增加。(8)MTT法检测细胞增殖结果显示,干扰hMTERF3基因表达后能抑制HeLa细胞增殖。(9)流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,干扰hMTERF3基因表达后能促进HeLa细胞凋亡。结论(1)基于TCGA、GEPIA和Oncomine数据库获取hMTERF3在人宫颈癌组织中表达的相关信息,通过对数据库进行大量数据挖掘和分析为宫颈癌的临床治疗提供了重要线索和数据支持。(2)构建及筛选针对hMTERF3基因的RNA干扰真核表达载体,为后续研究hMTERF3基因对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响提供了实验基础。(3)干扰hMTERF3基因,可以促进线粒体DNA的复制及提高粒体基因转录水平,抑制细胞增殖,促进HeLa细胞凋亡和线粒体ROS水平。以上研究为深入探讨hMTERF3对子宫颈癌恶性生物学行为影响提供了理论指导和实验基础。