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体色是生物一个重要的生物学性状,在生物体的生存、伪装、求偶和繁衍中起着重要作用。鱼类体色丰富多样,其不同体色图案的形成涉及了色素的合成与转移以及色素细胞的分化与运输,且许多基因参与调控该过程。黑素亲和素（melanophilin,Mlph）是Rab效应蛋白的一个亚家族成员,在脊椎动物的成熟黑素小体运输过程中起着关键性作用,其突变会引起动物的毛色变淡等现象发生,但目前其在水产动物中的研究却极为薄弱。本研究以瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var.color）和模式生物斑马鱼（Danio rerio）为研究对象,分析了Mlpha基因在不同部位和不同发育时期的表达差异,进而应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对这两种鱼类进行基因敲除,利用养殖生物学和分子生物学等研究方法对其敲除突变体进行筛选以及相关基因表达量的差异分析。初步探讨了Mlpha基因对鱼类黑斑体色的影响。相关研究结果如下:1.瓯江彩鲤Mlpha基因SNP位点筛选及时空表达差异分析Mlph基因是编码Rab效应蛋白亚家族的成员之一,是成熟黑素小体转运的重要基因。本章通过基因克隆证实了瓯江彩鲤存在两个Mlpha基因,两者在碱基序列上具有91.89%一致性,氨基酸序列的相似度达78.63%,遗传进化分析表明其紧密聚集在鲤形目这一分支上。通过Sanger测序分析确认了瓯江彩鲤的两个Mlpha基因的SNP位点,其中Mlpha1有两个关联SNP位点,分别为:A/G（A69G）和G/A（G93A）,G/C（G468C）和A/G（A485G）。Mlpha2有一个G/A（G1008A）SNP位点。六种体表色彩荧光定量表达结果显示Mlpha1在黑色皮肤中的表达水平显著高于相应的红色皮肤和白色皮肤,且Mlpha1在全红中的表达水平最低;而Mlpha2的定量结果与其相反。不同发育时期的定量表达结果发现,Mlpha1和Mlpha2均在鱼苗期（孵化后）显著高于胚胎期（孵化前）。结合表型观察与原位杂交实验发现,“大花”和“粉花”在孵化后3天的尾部和鳃处有明显的Mlpha1和Mlpha2探针信号,随后几天沿着神经嵴依次迁移到腹部和整个皮肤;而在“全红”体中,孵化后3天时Mlpha1和Mlpha2则均分布在尾部、鳃和腹部,并且在相同视野和相同时期的“大花”、“全红”中,Mlpha1的探针信号明显少于Mlpha2。综上结果表明,Mlpha在瓯江彩鲤中是一个不可或缺的功能基因,可能参与色素的运输,且Mlpha1和Mlpha2复制后可能存在功能分化。瓯江彩鲤的Mlpha的SNP位点可为今后的分子辅助标记育种研究提供了基础。2.基因编辑Mlpha基因对斑马鱼黑色条纹的影响本章以斑马鱼为研究对象,分析了Mlpha基因在斑马鱼不同发育阶段的表达情况,应用CRISPR/Cas9技术对该基因进行了敲除实验,观察了F2纯合突变体的表型变化。结果发现:Mlpha基因在斑马鱼中并没有加倍现象,且在不同发育时期均能表达,且在出膜后5 d（即腹部出现较明显黑色素带时期）的表达量最高。Mlpha基因敲除后,嵌合型突变体的胚胎和幼鱼黑色素扩散缓慢,成鱼体表黑色条带断裂,部分黑色素细胞急剧缩小。F2纯合突变体由于移码突变导致终止子提前出现,从而使Mlpha基因的蛋白翻译被截断,其成鱼体表的黑色素细胞也急剧缩小。通过原位杂交和定量表达分析,发现与Mlpha基因相互作用的转运基因,即小GTP结合蛋白（Rab27a）和肌球蛋白Va（myosin Va,Myo Va）的表达量在纯合突变体中也显著降低（P＜0.05）。本研究表明,Mlpha基因突变影响了黑色素的运输过程,从而导致斑马鱼黑色条纹的形成受阻。研究结果为了解鱼类黑斑体色形成的遗传基础与机制提供了有益的参考依据。3.基因编辑瓯江彩鲤Mlpha基因对黑斑体色及转运基因的影响Mlph基因在脊椎动物的成熟黑素小体运输过程中起着关键性作用,其突变会引起动物的毛色变淡等现象发生。本章通过养殖生物学和分子生物学等研究方法对瓯江彩鲤Mlpha敲除嵌合体进行筛选及相关转运基因进行了荧光定量表达,并利用斑马鱼Mlpha敲除纯合体进行了Mlpha1和Mlpha2基因的挽救实验。通过表型和基因型对比发现,大部分的Mlpha敲除嵌合体有明显的变化,其体表呈现有三种体色区域,分别为:黑色、浅黑色、红色或白色。其中浅黑区域的黑色素明显减少,并且黑色素颗粒处于缩小分散状态,其基因型呈现出大片碱基序列缺失的现象。在嵌合体中不同体色区域进行转运基因的表达分析,结果显示肌球蛋白Va（myosin Va,Myo Va）在Mlpha嵌合体中整体呈现表达显著下降趋势（P＜0.05）,小GTP结合蛋白（Rab27a）在Mlpha嵌合体黑色皮肤组织中表达量明显下降,而白色皮肤组织明显上升。在挽救实验的结果中发现,其突变表型能够被修复。以上结果表明在瓯江彩鲤中Mlpha基因（Mlpha1和Mlpha2）很保守,其突变可能导致其与Myo Va和Rab27a结合的功能丧失从而影响黑色素的转运,且Mlpha基因可能也参与其他色素的转运。