巴豆为大戟科植物巴豆Croton tigliumL.的干燥成熟果实。始载于《神农本草经》,被列为下品,性热、味辛,有大毒。临床可用于治疗咳喘、胃肠道疾病(膨胀证、小儿虚寒腹痛)、肠梗阻等疾病。但因巴豆有大毒,临床应用必需炮制以降低毒性,炮制方法主要是加热后压榨去油制霜,所得炮制品称之为巴豆霜。巴豆的毒性可表现为,在炮制加热蒸制生产过程中,挥发的蒸汽易造成操作人员皮肤黏膜红肿,发泡,产生急性炎症;临床中毒案例记载误服巴豆会引起口腔,咽喉灼热、刺痛,呕吐,并且造成严重腹痛腹泻研究表明巴豆中主要毒性成分为脂肪油,对皮肤和肠道具有强烈的致炎作用,同时也是泻下作用的药效成分。因此历代炮制方法均有压去油制霜,降低其脂肪油含量,《中国药典》2015版中记载2种不同的巴豆制霜方法-稀释法和热压法(稀释法是加适量淀粉,热压法为加热后压去油),规定脂肪油含量为1 8%-20%。然文献研究也显示,巴豆中的蛋白类成分具有溶血毒性,有学者提出巴豆蛋白亦是巴豆的毒性成分,但也有学者认为巴豆蛋白无毒。因此巴豆蛋白的毒性一直未有定论。课题组前期研究显示,巴豆蛋白具有较强的肠道炎症毒性,但巴豆蛋白造成肠道毒性机制不明。在巴豆霜的两种制霜方法中,稀释法是将巴豆碾碎,加适量淀粉稀释巴豆中的脂肪油至一定含量;热压法是将巴豆先加热蒸制后压去油制霜,即热压法工艺中第一步为加热蒸制。那么,加热蒸制是否会影响巴豆蛋白的毒性?不同制法所得的巴豆霜是否存在肠道毒性差异,对此还未见相关研究报道。为进一步研究不同制法巴豆霜肠道毒性差异及巴豆蛋白造成肠道炎症的初步机制。本论文记载的炮制方法制备了稀释巴豆霜、热压巴豆霜及冷压巴豆霜(不加热去油)3种不同的巴豆霜炮制品,从整体动物水平研究巴豆及不同炮制方法制备的巴豆霜对肠道炎症毒性和肠道单层屏障功能损伤差异,并从细胞分子水平对巴豆蛋白造成肠道炎症的机制进行初步研究。论文主要的工作内容及研究结果如下:1.巴豆及不同炮制方法制备的巴豆霜对肠道毒性影响的研究将生巴豆分别采用热压去油、冷压去油和淀粉稀释法炮制获得3种巴豆霜。以40mg/kg、160mg/kg连续灌胃给药7天。采用Real-time PCR法测定生巴豆及不同炮制方法制备的巴豆霜对十二指肠、空肠、回肠、结肠炎症因子TNF-α和IL-lβ mRNA表达水平的影响。结果显示,生巴豆能够显著增加小鼠十二指肠、空肠及回肠炎症因子mRNA水平;与生巴豆组相比,3种巴豆霜组的小鼠肠道炎症因子mRNA表达均显著降低。不同炮制方法制备的巴豆霜组炎症因子mRNA表达存在差异,对肠道炎症毒性大小顺序为:冷压巴豆霜>稀释巴豆霜>热压巴豆霜,热压巴豆霜毒性最低。为进一步研究巴豆及不同炮制方法制备的巴豆霜对肠道屏障功能损伤的差异。采用ELISA法测定小鼠血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸含量,采用Western blot法测定不同肠段中紧密连接蛋白(occdudin,claudin-1)表达水平。结果显示生巴豆能显著提高血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸的含量,降低十二指肠、空肠紧密连接蛋白表达;与生巴豆组相比,3种巴豆霜组血清中DAO和D-乳酸含量显著降低,肠道紧密连接蛋白表达显著上升。不同炮制方法制备的巴豆霜肠道屏障损伤存在较大差异,损伤大小顺序为:冷压巴豆霜>稀释巴豆霜≈热压巴豆霜,与肠道炎症毒性顺序一致。表明生巴豆能破坏肠道上皮屏障功能,制霜后损伤降低。综上结果表明,经稀释或加热炮制均能降低巴豆霜毒性,但加热过程减毒作用更为显著,表明加热蒸制是巴豆制霜过程中不可省略的关键步骤。2.不同炮制方法制备的巴豆霜中脂肪油和蛋白差异的研究GC-MS法分析不同巴豆霜中脂肪油的组成,结果显示,制霜后脂肪油含量降低,不同巴豆霜中脂肪油含量和组成基本一致。表明巴豆的不同制霜方法对脂肪油含量和组成无明显影响。采用BCA法测定各巴豆霜PBS水溶液中蛋白含量,结果显示,不同炮制方法制备的巴豆霜中蛋白含量差异明显,含量高低(按生药量折算)顺序为:巴豆=冷压巴豆霜=稀释巴豆霜>热压巴豆霜。表明热压制霜法对巴豆霜中蛋白具有显著影响。但相同质量巴豆霜中蛋白含量顺序:冷压巴豆霜>热压巴豆霜>稀释巴豆霜。分析结果可见,稀释法制备巴豆霜的过程是淀粉对巴豆蛋白进行了稀释;热压制霜法和冷压制霜法实际是对蛋白进行了富集,但热压法的蛋白含量显著低于冷压法,表明加热蒸制对巴豆蛋白具有显著的影响。采用SDS-PAGE(变性凝胶电泳)法分析不同巴豆霜PBS水溶液中蛋白的组成变化。在相等质量上样的条件下,冷压巴豆霜和稀释巴豆霜中蛋白分子量条带与巴豆一致,热压巴豆霜中蛋白分子量条带明显减少,表明经过加热蒸制的炮制工艺,巴豆霜中的蛋白发生了明显的变化。分析第一章实验结果不同炮制方法制备的巴豆霜毒性大小顺序:冷压巴豆霜>稀释巴豆霜>热压巴豆霜,结合本章相等质量巴豆霜中蛋白含量测定结果,表明不同炮制方法制备的巴豆霜之间毒性差异可能是由于巴豆不同制霜方法对蛋白含量及组成产生不同影响所造成的。3.巴豆总蛋白模拟炮制为进一步研究不同蒸制时间对巴豆总蛋白的影响,采用饱和硫酸铵沉淀法提取巴豆总蛋白,对其进行模拟炮制。结果表明,随蒸制时间延长(0,1,2,5,10,20,40min),蛋白在PBS中的溶解度逐渐降低,上清中蛋白含量减少,表明在蒸制过程中巴豆总蛋白发生变性,不再溶于PBS。SDS-PAGE法研究发现随着蒸制时间延长,巴豆总蛋白分子量条带逐渐减少,变淡。表明加热蒸制对巴豆总蛋白的溶解度(水溶性)及组成具有显著的影响。进一步对巴豆总蛋白蒸制后上清与沉淀进行研究,SDS-PAGE实验发现,巴豆总蛋白PBS上清液中减少的蛋白分子量条带,存在于沉淀中,说明蒸制中巴豆总蛋白发生变性。通过5800 MALDI-TOF/TOF检测蒸制前后巴豆总蛋白上清液中小分子肽段,结果发现巴豆总蛋白蒸制后上清中出现小分子肽段,说明蒸制中巴豆总蛋白发生降解。综上表明热压制霜法的加热蒸制过程能够通过部分蛋白变性和降解,降低巴豆霜中水溶性蛋白含量,并改变其组成。4.巴豆总蛋白加热蒸制前后毒性变化研究采用Western blot法检测巴豆总蛋白蒸制前后对IEC-6细胞紧密连接蛋白表达的影响。结果显示,与空白组相比,巴豆总蛋白(10,20,40 μg/mL)可显著降低紧密连接蛋白occludin和claudin-1表达;蒸制30min的巴豆总蛋白,则无明显作用,与未蒸制的巴豆总蛋白组相比,呈显著性差异。为进一步研究巴豆总蛋白加热蒸制前后对肠上皮细胞单层屏障通透性的影响。本论文将IEC-6细胞于Transwell小室中培养9天,建立IEC-6细胞单层屏障。以FD4(异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐,分子量为4kDa)透过率为指标,评价巴豆总蛋白对单层屏障通透性的影响。结果表明,与空白组相比,巴豆总蛋白(10,20,40 μg/mL)能显著增大IEC-6细胞单层屏障对FD4透过率。与未蒸制巴豆总蛋白组相比,蒸制30min的巴豆总蛋白组FD4透过率显著降低。表明巴豆总蛋白能够增大细胞单层屏障通透性,加热蒸制后对通透性损伤作用显著降低。采用ELISA法和Real-time PCR法检测巴豆总蛋白蒸制前后对RAW264.7巨噬细胞炎症因子释放的影响。结果显示,与空白组相比,巴豆总蛋白(5,10,20 μg/mL)能够明显升高巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-1β mRNA水平,并促进炎症因子的释放;与未蒸制组相比,蒸制30min的巴豆总蛋白导致炎症因子mRNA水平和释放显著降低,表明炎症毒性降低。根据大分子物质造成肠道炎症往往先破坏肠道上皮屏障功能,然后进入固有层,刺激免疫细胞释放炎症因子。本论文模拟体内肠道结构,建立IEC-6细胞单层屏障和巨噬细胞Transwell共培养模型,采用FITC标记巴豆总蛋白,研究巴豆总蛋白是否通过IEC-6细胞单层屏障,进入Transwell下室刺激巨噬细胞释放炎症因子。结果显示,随巴豆总蛋白剂量的增大(10,20,40μg/mL),下室荧光值增大,表明FITC-巴豆总蛋白的透过率增大,说明巴豆总蛋白可破坏IEC-6细胞单层屏障。同时随进入下室的巴豆总蛋白含量的上升,巨噬细胞炎症因子mRNA水平显著提高。与未蒸制组相比,蒸制30min的巴豆总蛋白组,进入下室的巴豆总蛋白含量显著减少,巨噬细胞炎症因子mRNA水平显著下降。综上结果表明,巴豆总蛋白能够通过降低IEC-6细胞间紧密连接蛋白表达,增大细胞单层屏障通透性,进而刺激巨噬细胞释放炎症因子。加热蒸制可以显著降低对IEC-6细胞单层屏障功能的损伤及巨噬细胞的炎症毒性,表明蒸制可以降低巴豆总蛋白的毒性。5.巴豆总蛋白分离纯化及毒性蛋白的鉴定为进一步研究巴豆中的毒性蛋白,采用疏水层析柱和凝胶柱层析,主要分离得到4种蛋白:蛋白F2、蛋白F3-F1、蛋白F3-F2和蛋白F4-F3,均达到电泳纯。采用SDS-PAGE法测定其相对分子量大小:蛋白F2(39.8kDa),蛋白F3-F1(39.2kDa),蛋白F3-F2(14.2kDa),蛋白F4-F3(13.3kDa)。论文对4种蛋白的毒性进行比较研究,结果显示,以巨噬细胞释放炎症因子TNF-αIL-1β及降低紧密间接蛋白occludin和claudin-1的表达为指标,蛋白F3-F1毒性最强。以FD4透过率及共培养模型中巨噬细胞炎症因子mRNA水平为指标,蛋白F2毒性最强。采用LC-MS/MS对蛋白F2和F3-F1进行初步鉴定发现蛋白F2和F3-F1中包含多种蛋白,其中热休克蛋白70序列为两者共有的蛋白序列,且文献研究发现热休克蛋白具有炎症毒性。为进一步确定热休克蛋白70是否存在于两种蛋白中,并采用Western blot法对鉴定结果进行验证。结果显示,两者中均具有与热休克蛋白70结构域相似的蛋白。总结1.本论文研究发现巴豆可致肠道炎症和肠上皮屏障功能损伤。制霜后3种不同炮制方法制备的巴豆霜肠道毒性降低,毒性大小:冷压巴豆霜>稀释巴豆霜>热压巴豆霜。稀释法制霜过程中能够稀释巴豆中蛋白含量,降低巴豆霜毒性。热压法可致蛋白变性和降解,降低水溶性蛋白含量及改变起组成,热压巴豆霜毒性最低。2.论文建立IEC-6细胞单层屏障及其与巨噬细胞Transwell共培养模型。巴豆总蛋白能够降低IEC-6紧密连接蛋白表达,增大细胞单层屏障通透性,导致细胞屏障功能受损,进入下室,刺激巨噬细胞释放炎症因子。蛋白蒸制后对肠道细胞屏障功能损伤作用显著降低,对巨噬细胞的炎症刺激亦显著减弱。表明巴豆总蛋白刺激巨噬细胞释放炎症因子导致的肠道炎症与其破坏屏障功能有关,加热蒸制可降低巴豆总蛋白的毒性。因此加热蒸制是巴豆制霜过程中不可省略的关键步骤。3.从巴豆总蛋白中分离得到4种蛋白,蛋白F2(39.8kDa),蛋白F3-F1(39.2kDa),蛋白F3-F2(14.2kDa),蛋白F4-F3(13.3kDa)。4种蛋白均对巨噬细胞具有炎症毒性及破坏单层细胞屏障功能,其中蛋白F2和F3-F1毒性最强。两者中均具有与热休克蛋白结构域相似的蛋白。