背景：重症肌无力(Mvasthenia gravis, MG)是一种影响神经--肌肉接头致神经冲动传递障碍的自身免疫性疾病。其不同程度地影响患者的生活质量,给患者造成较大伤害。从世界范围看,MG近50年的发病率和患病率有上升趋势,我国人口基数大,妇女和儿童是主要的罹患者。目前,现代医学的非特异性免疫抑制及对症治疗虽然能在一定程度上缓解患者的临床症状,但有较大的毒副作用；外科干预及放疗只是在部分患者中有效,疗效不稳定。中医药干预MG有效,能明显提高患者的生存质量,减轻西药的副作用。目前有多方面MG中医病机认识,但失于整体指导性,深化MG中医病机认识有重要意义。业已证明,MG患者肌纤维损害最常见的是神经源性和肌源性,针对肌纤维损伤目前仍无特异的干预手段。我们前期的工作表明：MG患者的肌纤维损害,经健脾益气为主的中药治疗后肌纤维损害状况得到改善,但其具体作用机制还不明确。目的：1在临床疗效的基础上,分析刘友章教授治疗MG的临床用药特点,采集分析MG患者脉象,深化MG中医病机认识。2检测MG大鼠与肌肉收缩密切相关的肌纤维蛋白：肌球蛋白调节轻链2(MLC2)、快骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ亚基(TnIfs)、原肌球蛋白亚型3(TPM3)、肌球蛋白重链Ⅱb(MHCⅡb)、肌动蛋白α (α-actin)的基因及蛋白表达,初步探讨中医药改善MG肌无力症状的分子机制。3行MG大鼠肌肉组织蛋白组学研究,筛选、鉴定差异蛋白,从肌肉组织蛋白质组学的角度探讨以健脾益气为主的中药干预MG的作用机制。方法：1病例收集收集2009年9月--2012年3月广州中医药大学第一附属医院刘友章教授门诊部MG患者的病历,记录用药频数,用SPSS13.0行聚类分析；脉象采集由具有40余年临床经验的刘友章教授独自采集。2实验造模、分组、给药健康SPF级雌性Lewis大鼠36只,随机取6只作为正常组,剩余大鼠进行EAMG造模,免疫乳剂200μ l(R97～116、CFA、PBS比例为1：1.5：1.5,含R97-116：100μ g)首次免疫后30天及45天,再取乳剂200μ1(R97-116、IFA、PBS比例1：3：3,含R97-116：50μ g)强化接种,对照组注射等量PBS,第6W末成模。成模2W后各组予灌胃给药4W,每日1次。正常组：灌胃与治疗组同容积的生理盐水；模型组：灌胃与治疗组同体积的生理盐水；强的松组：灌服强的松5.4mg/kg·d;健脾益气方高剂量组：灌服健脾益气方37.6g/kg·d；健脾益气方低剂量组：灌服健脾益气方18.8g/kg·d。以上各组给药量为10ml/kg体重,其浓度及等效剂量按体重折算。3取材治疗4W后,禁食12h,处死大鼠,分离腓肠肌,置一80℃冰箱保存。4指标检测4.1基因及蛋白检测荧光定量PCR法及Western blots法检测各组大鼠骨骼肌α-actin、TPM3、TnIfs、 MHCⅡb、MLC2基因及蛋白表达。4.2肌肉蛋白质组学提取正常组、模型组、健脾益气方高剂量组肌肉组织总蛋白,2-DE法获取差异蛋白点,MALDI-TOF-TOF MS鉴定差异蛋白。结果：1药物应用特点①纳入本研究的1-40岁患者56个,其中18岁以下患者31个,18岁以上患者25个,共调查420个处方,用药总数为144味；纳入本研究40岁以上患者41个,共调查231个处方,用药总数为117味。②1-40岁患者药物应用2聚类分析表明,柴胡、升麻、牛大力、千斤拔、黄芪、甘草、五爪龙、独脚金、白术、龙骨、杜仲为主要药物；3、4聚类分析表明,柴胡、升麻、牛大力、千斤拔是其干预MG的主要药物。③40岁以上患者药物应用2聚类分析表明,柴胡、升麻、白术、千斤拔、黄芪、杜仲、龙骨、牛大力、五爪龙、独脚金、巴戟天是干预MG的主要药物；3、4聚类分析表明柴胡、升麻、白术是常用药物。④其他频数较高的药物还包括：苏叶、砂仁、陈皮、楮实子、巴戟天、艾叶、丹皮、桑寄生、当归、太子参、白背木、枸杞子、薏苡仁、川太、板蓝根、金樱子、党参等。⑤归纳：刘友章教授临床干预MG用药种类繁多,是辨证论治、个体治疗、“三因制宜”的体现；柴胡、升麻、牛大力、千斤拔、黄芪、甘草、五爪龙、独脚金、白术、龙骨、杜仲、巴戟天的应用均以升发脏腑清阳、健脾益胃、补肝益肾、祛除病邪、疏通经络为目的,为大气的生成及运行创造必要条件。2脉象特点①采集97例MG患者脉象,其中弱脉90例,细弱脉39例,弦细脉29例,左关不举66例,尺脉沉56例,脉象不畅81例,洪大脉7例。②归纳：MG患者脉象以弱、细为主,为气虚的表现,左关不举则肝气虚、尺脉沉则元气不充,大气源于肾,萌于肝,充于脾,蓬勃于胸中,以上脉象符合MG大气虚损的病机。3各组大鼠骨骼肌α-actin、TPM3、TnIfs、MHCⅡb、MLC2基因表达本研究显示：①和正常组相比,α-actin mRNA于模型组中表达降低(P<0.05),经强的松干预后无明显升高(P<0.05),而中药高、低剂量组表达量和正常组无明显差异性(P>0.05)。②和正常组相比,MHCⅡb mRNA于模型组中表达明显升高(P<0.05),经强的松干预后其表达量趋于正常(P>0.05),而经高、低剂量健脾益气方干预后其表达量和正常组及模型组相比明显降低(P<0.05)。③和正常组相比,TnIfs mRNA于各组中表达明显降低(P<0.05)。④和正常组相比,MLC2mRNA在模型组中表达有升高趋势,在强的松组、健脾益气方高、低剂量组中表达明显升高(P<0.05),并以低剂量组升高最为明显。4MG大鼠骨骼肌α-actin、TPM3、TnIfs、MHCⅡb、MLC2蛋白表达本研究显示：①和正常组相比,α-actin于模型组中表达降低,经强的松干预后其表达有所升高,高、低剂量健脾益气方干预后其表达量较模型组有所改善,并以低剂量组为佳,但仍然低于正常组,与α-actin mRNA表达基本相一致。②和正常组相比,MHCⅡb于模型组中表达降低,经强的松干预后其表达量明显降低,而经高剂量健脾益气方干预后其表达量基本趋于正常,而经低剂量健脾益气方干预后其表达量又明显降低。与MHCⅡb mRNA表达有较大差异。③和正常组相比,TnIfs于各组中表达明显不同于TnIfs mRNA的表达,其于模型组、强的松组、健脾益气方低剂量组中的表达升高,而于健脾益气方高剂量组中的表达降低。④和正常组相比,MLC2于模型组中表达降低,在强的松组、健脾益气方高、低剂量组中表达升高,并以低剂量组明显。⑤TPM3于模型组和强的松组中表达量和正常组基本一致,而高剂量健脾益气方干预后其表达量降低,低剂量健脾益气方干预后其表达量反而升高。5骨骼肌蛋白质组学选择三组差异蛋白点12个,和正常组相比,模型组9个蛋白点上调,2个下调,1个点在两组中表达量极低；和正常组相比,健脾益气方高剂量组5个点上调,7个点下调,3个点经干预后表达量极低；和模型组相比,健脾益气方高剂量组5个点上调,7个点下调。对12个差异蛋白点鉴定,有3个差异蛋白点表达一个蛋白的同型异构体,1个差异点蛋白未确认。鉴定出的9个蛋白分别为：①烯醇化酶3,②肌酸激酶M型,③肌球蛋白轻链3,④肌球蛋白调节轻链2,⑤维生素D结合蛋白-骨骼肌肌动蛋白络合物晶体结构A链,⑥ATP合成酶β亚基,⑦醛糖还原酶,⑧苹果酸脱氢酶,⑨肌球蛋白轻链1f。本研究显示：①经高剂量健脾益气方干预后,烯醇化酶3较模型组及空白组明显减少。②和正常组相比较,肌酸激酶表达量于模型组中明显升高,而经高剂量健脾益气方干预后其表达量与正常组及模型组相比表达量降低。③和正常组相比,肌球蛋白轻链3在模型组中的表达明显升高,而经高剂量健脾益气方干预后其表达量降低。④MLC2表达3个同型异构体蛋白点,和正常组相比,模型组MLC2表达量升高,而高剂量健脾益气方干预后仍呈降低状态。⑤和正常组相比,维生素D结合蛋白-骨骼肌肌动蛋白络合物晶体结构A链在模型组及健脾益气方高剂量组中的表达量均降低。⑥经高剂量健脾益气方干预后,ATP合成酶β亚基表达量较空白组及模型组明显升高。(7)rCG51106, isoform CRA_b蛋白未确认。⑧醛糖还原酶于模型组中表达升高,经高剂量健脾益气方干预后其表达量亦增高。⑨和正常对照组相比,苹果酸脱氢酶于模型组及健脾益气方高剂量组中的表达均明显下降。⑩和正常组相比较,肌球蛋白轻链1f于模型组表达量升高,而经高剂量健脾益气方干预后其表达量降低。结论：MG发病机制复杂,中医药临床干预当辨证论治；柴胡、升麻、牛大力、千斤拔、黄芪、甘草、五爪龙、独脚金、白术、龙骨、杜仲、巴戟天为干预MG的主要药物,且能揭示MG大气虚损的病机；MG治疗当重升发脏腑清阳、补脾益胃、补肝益肾、祛除病邪、疏通经络,为大气的生成及运行创造条件；以大气虚损指导MG临床治疗具有重要意义。MG大鼠中,与肌纤维收缩密切相关的蛋白的基因及蛋白表达异常,健脾益气方改善MG大鼠肌无力症状与其改善肌纤维收缩蛋白的基因及蛋白表达相关,且有剂量依赖性。蛋白质组学研究显示：MG大鼠肌肉组织存在炎性改变及能量代谢异常,高剂量健脾益气方改善MG大鼠肌无力症状与调节肌肉组织有氧氧化、无氧酵解及减轻MG大鼠肌肉组织炎症相关；高剂量健脾益气方改善MG大鼠肌无力症状的机制具有复杂性。