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凹叶厚朴差减文库的构建及序列分析可以有效找出其主要抗寒相关功能基因,分析代谢途径。进而对与凹叶厚朴亲缘关系相近的植物抗低温特性遗传育种提供理论基础,并且有助于对植物的自然栽培的研究。实验从植物低温胁迫到最终测序的差减文库构建过程中共做了三次重复,以减少非抗寒相关基因在文库中所占的单个比例。具体研究结果如下：1、对凹叶厚朴在不同温度下的电导率进行测定,运用Logistic方程Y=K/(l+aebx)进行拟合数据处理,得回归方程为：y=0.7526/(1+18.925e-0.372x),半致死温度为-7.93℃。2、取两盆凹叶厚朴苗每放于25℃人工气候培养箱培养7天,七天后将一盆凹叶厚朴留于人工气候培养箱中,作为Driver组。将另一盆凹叶厚朴于生长期转移-8℃的人工气候培养箱中培养3天,作为Tester组。用Trizol法提取了植物总RNA,利用SMART法合成全长cDNA,后进行两轮差减杂交与两轮抑制性扩增得到杂交产物。插入片段的平均长度为0.65 kb,蓝白斑检测重组率为99.9%。3、三次重复实验测序后共获得了837条可用于后续分析的EST序列,将837条EST序列分别进行聚类拼接得到286条unigene-1,将unigene-1在NR数据库进行比对,选出了unigene-1比对结果相同或类似的基因合集171条unigene-2,将unigene-2进行第二次拼接得到60条unigene-3。4、将60条unigene-3进行NCBI蛋白数据库比对注释。注释结果显示有较多与抗逆相关蛋白如锌指家族蛋白、硫氧还蛋白、乙烯应答转录因子、过氧化物酶等。5、将60条unigene-3在blast2G0进行功能分类,结果共获得144个GO terms这些GO terms归为3类：其中生物学过程所占的GO terms最多(67),占46.52%,其次是分子功能(42),和细胞组件(35),分别占29.17%和24.31%。物种相似性最高为莲与葡萄,其次为麻疯树、柑橘、青梅、山胡椒、胡杨、油棕等。144个GO term中直接参与对对外界刺激的防御反应的有6个,如：对刺激的反应、信号、刺激细胞反应、核酸结合转录因子活性、氧化还原酶活性、磷酸酶活性等,占4.16%。6、在对60条unigene-3的信息处理后。根据NCBI数据库比对出的结果以及G0功能分类的结果,筛选出了11个最有可能参与抗寒应激防御的基因：FLS基因、F-box基因、LHCB1基因、WRKY基因、HSP70基因、APX基因、PP2C基因、Trx基因、ERF基因、DREB基因、GAPDH基因。7、荧光定量pcr显示F-box、APX、TRX、ERF、DREB等基因都随着温度的较低表达量不断增加,LHCB、WRKY、HSP、PP2C、GAPDH等在-8℃低温时由于温度过低代谢受到抑制因此表达量有所下降。ERF的基因表达量随着温度的降低而升高证明了这两个基因与温度的相关性较强。但在温度过低时植物代谢受到阻碍,基因的表达受到抑制,这是由于低温破坏了基因正常的代谢途径。8、最终推断F-box、APX、TRX、ERF、DREB、LHCB、WRKY、HSP、PP2C、GAPDH等10个基因在凹叶厚朴受到低温侵害时可能表现出了防御机制。