NLRP3炎症小体在高尿酸诱导的内皮细胞炎症反应中的作用研究

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目的:高尿酸血症已成为独立于高血压、糖尿病、肥胖等危险因素之外的引发心血管疾病和慢性肾脏病的危险因素。研究表明高尿酸血症患者血清炎症指标升高,说明高尿酸血症可引起机体炎症反应,进一步造成机体损伤。近年来在痛风性关节炎,慢性肾脏病,动脉粥样硬化,糖尿病等多种疾病中发现NLRP3炎症小体的组成成分明显升高。亮氨酸富集的核苷酸结合寡聚结构域(nucleotide-binding oligomerizotion domain, leucine-rich repeat and pyrin,domaincontaining; NLRP)是一类模式识别受体,NLRP3是其中研究最为清楚的一种受体蛋白,可与凋亡相关点样蛋白(Apoptosis-associated Speck-like protein containingcaspase recruitment domain; ASC)及胱天蛋白酶-1(caspase-1)前体结合并发生寡聚形成NLRP3炎症小体。NLRP3炎症小体激活的同时促进caspase-1前体的自我催化并形成活化的caspase-1,活化的caspase-1进一步剪切白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-18(IL-18)的前体至成熟形式并分泌到细胞外。以往研究表明NLRP3炎症小体的激活参与多种自身炎症性疾病的发病机制。NLRP3炎症小体在尿酸盐沉积导致的痛风性关节炎中起关键作用。利用基因敲除技术或使用特异性抑制剂阻断NLRP3,ASC或caspase-1的表达可显著降低促炎症细胞因子的产生。NLRP1炎症小体是较早发现的一种炎症小体,除NLRP1受体蛋白不同外,亦包含ASC及caspase-1前体,可感受刺激信号引起炎症反应。本研究拟进行体内及体外实验验证尿酸是否通过激活NLRP3炎症小体引起炎症反应。方法:将8周龄C57BL/6小鼠分为对照组和模型组,每组6只。模型组小鼠给予尿酸溶液(250mg/Kg·d)及氧嗪酸钾溶液(250mg/Kg·d)腹腔注射,连续10天,对照组给予相同剂量的生理盐水。10天后检测小鼠血尿酸水平,明确造模是否成功。Western Blot检测小鼠肾脏及主动脉组织NLRP3、caspase-1及NLRP1表达水平,组织免疫荧光检测主动脉及肾脏组织NLRP3、caspase-1及NLRP1表达情况,ELISA方法检测血清IL-1β及IL-18水平。培养人脐静脉内皮细胞(EAHY)分为对照组及高尿酸刺激组,高尿酸刺激组给予含600μM的培养液孵育12小时。Western Blot检测细胞内NLRP3、caspase-1及NLRP1表达的水平,ELISA方法检测细胞上清液中IL-1β及IL-18水平。利用siRNA技术及caspase-1抑制剂分别抑制细胞NLRP3及小鼠caspase-1的表达,检测高尿酸刺激对促炎症细胞因子表达情况的影响。结果:模型组小鼠血清尿酸浓度为187.4±43.5μmol/L,显著高于对照组小鼠,表明高尿酸血症小鼠模型建立成功。Western Blot检测肾脏组织及主动脉NLRP3、caspase-1表达量显著高于对照组,NLRP1表达未见明显变化。组织免疫荧光检测主动脉及肾脏组织可见肾小球及主动脉内皮细胞NLRP3、caspase-1荧光强度较对照组显著增强,NLRP1荧光强度未见明显变化。模型组小鼠血清IL-1β及IL-18浓度显著升高。EAHY细胞经高尿酸刺激后表达NLRP3、caspase-1显著增加,NLRP1未见明显变化,高尿酸刺激后细胞分泌IL-1β及IL-18显著增加。利用siRNA技术干扰细胞内NLRP3表达后可检测到细胞内NLRP3表达减少,表明siRNA干扰效果明显。细胞经siRNA干扰后给予高尿酸刺激,细胞内caspase-1的表达及IL-1β、IL-18的分泌较高尿酸刺激组显著降低。caspase-1抑制剂Z-VAD-fmk可有效抑制小鼠肾脏及主动脉caspase-1的表达,血清IL-1β及IL-18的浓度较模型组显著降低。讨论:高尿酸可引起小鼠及内皮细胞NLRP3炎症小体激活,促炎症细胞因子IL-1β及IL-18分泌增多。高尿酸不能导致NLRP1炎症小体的激活。抑制NLRP3或caspase-1的表达可降低高尿酸诱导的IL-1β及IL-18分泌。结果表明高尿酸通过激活NLRP3炎症小体引起细胞炎症反应。
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