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研究目的和背景难愈性、慢性创面和组织缺损引起的疼痛、生理功能障碍及身体外观变化严重影响患者的运动自由和生活质量,甚至危及生命。鉴于覆盖创面若使用自体和异体移植组织,其受来源、伦理和感染性疾病风险所限制,而具有良好性能的组织工程敷料更有发展空间。动物来源的异种生物材料的研究是一个热点,组织工程材料来源充足,生物相容性好,安全可靠,是很好的组织再生的支架,并没有同种异体生物材料移植的伦理问题,易于规模化制备。其中猪小肠粘膜下层（small intestinal submucosa,SIS）具备免疫源性较低、组织相容性良好、生长因子含量高、可降解等优点,是一种理想的生物源性材料。但SIS仍存在不足之处:首先SIS为薄膜状材料,缺乏足够的三维结构,限制了其应用领域;其次,SIS结构致密,缺乏疏松的孔径结构,不利于细胞的迁移爬行及营养物质的交换。在前期实验过程中我们课题组发现了一种新的SIS交联方法,创新性的制备了SIS冷冻凝胶,该方法制备的新型三维生物支架材料具有弹性变形和形状记忆能力。我们在SIS冷冻凝胶基础上再度研发出脱细胞SIS膜与SIS冷冻凝胶复合的SIS仿生双层敷料。通过生物学和物理性能的测试,评价其作为支架细胞移植及作为敷料覆盖创面的可行性,进一步为修复创面、组织重建等应用提供理论依据。通过扫描电镜观察其复合结构,了解其特征。测试其机械性能、细胞毒性、促进创面愈合能力。通过体外细胞复合培养证实了下层SIS冷冻凝胶可主动吸附细胞,并且细胞能在双层支架材料上粘附生长。双层材料的生物、物理性能良好,既结合了冷冻凝胶的多孔三维支架结构,抗压能力强,不易碎裂,又结合了SIS膜的良好机械性能,较少的孔隙率,抗张能力强,可以抗细菌侵袭。既是一种可用于细胞及药物移植的支架,也可以单独使用,利用其对有核细胞的捕获作用[1],来发挥组织工程支架作用,在组织重建、创面修复方面有广泛的应用前景。研究方法研究分五部分第一部分:脱细胞SIS膜的及SIS粉末的制备1.采用机械刮除及脱脂、胰蛋白酶消化、去垢剂清洗等序贯步骤制备脱细胞SIS膜。2.将SIS膜低温粉碎后,胃蛋白酶将其消化过滤、离心、盐析、透析、冻干,制备脱细胞SIS粉末。第二部分:SIS冷冻凝胶及仿生双层敷料支架的制备1.将SIS粉末与SIS膜冷冻交联时复合在一起形成双层结构。2.扫描电镜观察SIS双层的微观结构和孔径。3.对SIS双层的力学性能和水蒸气透过率（water vapor transmission rate,WVTR）进行了研究。第三部分:SIS仿生双层敷料支架的抗细菌侵袭作用通过向SIS仿生双层敷料支架及其他对照不同材料表面接种细菌,用平板计数测量细菌穿透各种材料的量,比较各自阻挡细菌入侵的能力;第四部分:SIS仿生双层敷料支架体外细胞培养1.GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养。2.荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察。3.将其与商业化明胶海绵等作对比,CCK-8试剂盒检测细胞毒性。第五部分:SIS仿生双层敷料支架促进创面愈合1.制作小鼠全层皮肤缺损创面模型,与空白对照组,商品化明胶海绵组,SIS膜组,SIS冷冻凝胶组进行对照,观察各组材料对创面愈合的影响;2.通过qPCR测量PCNA、E-cadherin和CD31表达,观察双层胶仿生材料对创缘细胞增殖和创面血管化的影响;研究结果1.成功制备了脱细胞SIS膜,SIS粉末。扫描电镜显示,SIS膜表面呈网状结构,未见明显细胞形态。2.成功制备了具有弹性形变和形状记忆功能的SIS冷冻凝胶以及复合SIS脱细胞膜而成SIS仿生双层敷料支架。扫描电子显微镜观察表明,表面为脱细胞SIS膜,其下紧密结合SIS冷冻凝胶,二者结合紧密,表层致密,下层多孔。进行力学和水蒸气透过测试表明,材料机械性能出色,杨氏模量10.95MPa、拉伸强度1.26MPa、断裂伸长率35.41%,水蒸气透过率656g/m2/day。3.细菌穿透实验发现,SIS仿生双层敷料支架与凡士林纱布组,商品化明胶海绵组,SIS膜组,SIS冷冻凝胶组进行对照比较,SIS双层和SIS膜可以显著的阻挡细菌的入侵,差异具有统计学意义（p<0.05,n=3）4.GFP转基因小鼠分离骨髓间充质干细胞体外培养,挤压SIS冷冻凝胶,滴加细胞悬液后可主动吸附细胞迅速反弹。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察结果显示,SIS双层材料有细胞粘附,细胞附着于支架表面及孔壁内呈扁平状、纺锤样、线样。CCK-8试剂盒检测结果显示,SIS双层材料组OD值大于商品化明胶海绵。5.小鼠皮肤全层缺损创面愈合情况,伤后3天,SIS双层组愈合速度明显快于明胶海绵组以及空白对照组的愈合率分别为63.22%,21.32%,12.18%,伤后7天创面愈合率分别为90.63%,67.27%,47.96%,差异有统计学意义（p<0.01,n=3）。伤后3天、7天SIS双层组的创面愈合率均显著大于商品化明胶海绵组、空白对照组;Quantitative Real-time PCR检测发现,SIS双层组细胞增殖标志物PCNA表达水平最高,SIS膜和明胶海绵组表达较低,差异有统计学意义（P<0.05,n=3）;同时检测了E-cadherin,表达最低在SIS双层组,约为35.32,明显低于最高值,明胶海绵组的72.09,差异具有统计学意义（P<0.05,n=3）;发现CD31的表达在7天时双层组（4.67）显著高于SIS膜组（2.05）、SIS冷冻凝胶组（2.39）、明胶海绵组（1.21）（P<0.05,n=3）。结论1.成功研制了SIS仿生双层敷料支架。由具有弹性形变和形状记忆功能的SIS冷冻凝胶以及脱细胞SIS膜复合而成一种三维组织工程支架,生物敷料,可降解。表层为脱细胞SIS膜,其下紧密结合SIS冷冻凝胶,二者结合紧密,表层致密,下层多孔。进行力学和水蒸气透过测试表明,材料机械性能出色,水蒸气透过率适当。并具有良好的抗菌作用。2.SIS仿生双层敷料对细胞的增殖有良好的促进作用。SIS冷冻凝胶的多孔结构,对细胞迁移和营养物质交换有促进作用。交联剂EDC不增加SIS材料的细胞毒性。支架表面和孔壁上可见细胞附着生长。3.SIS仿生双层敷料对创面有促进愈合作用。上层致密SIS膜具备防止细菌入侵的屏障作用及加强保湿和机械性能的作用,下层的SIS冷冻凝胶多孔结构则利于创面细胞的增殖和修复。此外,SIS材料具备的良好的理化性能和生物学特性,可以有效地保护创面并建立创面局部良好的微环境,促进创面修复。