基于氧化应激探讨Omi/HtrA2对大脑皮质的作用

来源 :吉林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Horus_Ra
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线粒体既是能量代谢的场所,也是产生活性氧的主要来源。线粒体功能障碍时,氧化磷酸化功能障碍,ATP合成减少,同时活性氧产生增加,进一步加重线粒体功能障碍。线粒体中存在的各种线粒体蛋白及酶类是保障线粒体正常功能的基础。目前的研究表明,线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2是存在于哺乳动物线粒体膜间隙一种重要的蛋白酶,具有清除错误折叠蛋白或帮助其进行正确折叠的作用。但是在凋亡信号刺激时,Omi/HtrA2从线粒体释放到胞浆中,直接裂解凋亡抑制蛋白(XIAP),促进程序性细胞凋亡。运动神经元变性2(mnd2)纯合小鼠,具有纹状体严重神经变性,运动神经元损伤,存活时间短等特点,这与Omi/HtrA2中的错义突变S276C导致Omi蛋白酶活性的显着损失有关,但具体机制不清楚。因此本实验,主要从氧化应激的角度探讨由于Omi/HtrA2突变导致mnd2纯合小鼠中枢神经损害的机制。方法:1.mnd2小鼠按照基因型不同分为三组:野生型(+/+)、杂合子(+/-)、纯合子(-/-)。通过HE染色观察不同组之间小鼠脑皮质细胞的变化。通过透射电镜观察不同组之间小鼠脑皮质中线粒体变化。采用PCR Array和RT-PCR技术检查各组小鼠线粒体能量代谢相关基因和Omi/HtrA2基因水平表达。采用试剂盒检测SOD活性及MDA含量,反映脑皮质中氧化应激状态。通过Western blot检测各组小鼠脑皮质线粒体应激蛋白、线粒体分裂融合蛋白、线粒体呼吸链复合物以及凋亡相关蛋白的表达。通过Tunel染色检查各组小鼠脑皮质细胞凋亡情况。探讨mnd2纯合小鼠中枢神经损害的机制。2.采用H2O2复制PC12细胞氧化应激损伤模型,并给予Ucf-101抑制Omi/HtrA2表达,探讨氧化应激对Omi/HtrA2的影响。实验分为三组:对照组、过氧化氢组,过氧化氢加ucf-101组。通过倒置显微镜观察不同组之间的细胞形态。通过免疫蛋白印记检查各组细胞线粒体应激以及凋亡相关蛋白的表达。结果:1.与野生型小鼠相比,mnd2纯合子小鼠出现体重不增、生长停止,并在30-40天死亡,同时出现脑萎缩等症状。HE染色结果显示,纯合子小鼠脑皮质细胞胞数目减少,排列紊乱,细胞皱缩。进一步电镜结果显示,纯合小鼠线粒体没有完整嵴结构,箭头所示,嵴结构破坏,折叠内膜结构完全丧失。说明线粒体损伤可能是脑损伤的重要原因。2.WesternBlot结果显示,与野生型相比,mnd2纯合子小鼠融合蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1长体蛋白表达水平降低,分裂蛋白Drp1蛋白表达水平升高,说明mnd2纯合子小鼠线粒体融合分裂障碍,这可能是导致线粒体结构损害的重要原因。3.与野生型相比,mnd2纯合子小鼠SOD活力下降,而MDA含量增加,说明纯合子小鼠自由基生成增加,而清除能力下降,ROS水平升高。进一步采用WesternBlot检测氧化应激相关基因的表达,结果显示,与野生型相比,纯合子小鼠Sirt3,SOD1,SOD2蛋白水平均降低,说明纯合子小鼠抗氧化能力下降。4.WesternBlot结果显示,与野生型相比,纯合子小鼠Hsp60、Hsp90、Hsp10、ClpP等线粒体应激相关蛋白的表达降低,说明纯合子小鼠,线粒体修复及清除错误折叠蛋白能力下降。5.PCR Array及Western blot结果显示,mnd2纯合子小鼠脑皮质的线粒体呼吸链复合物相关基因的表达降低,这是导致能量代谢障碍的重要原因。6.WesternBlot结果显示纯合子小鼠Cleaved-casepase3,Cleaved-casepase8,Cleaved-casepase9表达增加,XIAP短体增加。Tunel染色显示纯合子小鼠凋亡细胞增多,说明纯合子小鼠脑皮质损害加重。7.PC12细胞受到H2O2刺激,倒置显微镜下观察发现细胞状态变差,抑制Omi/HtrA2后,状态好转。WesternBlot结果显示,与对照组相比,H2O2组Sirt3蛋白表达降低,说明抗氧化能力下降;线粒体应激相关蛋白HSP60、ClpP蛋白表达降低,促凋亡蛋白Cleaved-Casepase3、Omi/HtrA2、XIAP裂解片段表达增加,说明PC12细胞损伤增加。而与H2O2组相比,H2O2+ucf-101组Sirt3蛋白表达升高,线粒体应激蛋白Hsp60、ClpP表达升高;Cleaved-Casepase3、Omi/HtrA2、XIAP裂解片段表达降低。说明Omi/HtrA2参与了氧化应激诱导的细胞凋亡。结论:1.Omi/HtrA2基因突变通过使自由基生成增加,而清除能力下降,导致ROS水平升高,造成线粒体结构和功能障碍,导致凋亡,使纯合子小鼠脑皮质损害加重2.Omi/HtrA2参与了氧化应激诱导的细胞凋亡。
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