紫杉醇和神经生长因子在嗅感觉神经元分化过程中的作用目的微竹作为细胞骨架的重要组成部分,与细胞形态的维持、细胞内物质的运输、细胞运动及细胞分裂增殖等生命活动密切相关。通常认为,有丝分裂过程中需要胞质微管的解聚以形成纺锤体微管,染色体在纺锤体微管的牵引下方能向两极移动,有丝分裂后,这些微管又重新解聚成微管蛋白。β3微管蛋白特异性地存在于神经细胞、滋养细胞中,在神经发生早期即有表达的唯一微管异构形式而常用于标志于细胞的神经分化,在成熟及未成熟的嗅感觉神经元中都有表达。紫杉醇通过与β3微管蛋白N端的31个氨基酸残基和中段的217-231氨基酸残基结合,增加组成微管的13根原丝的相互作用,稳定微管蛋白构象,从而抑制微管解聚,使细胞复制中止在M期,进而引起细胞凋亡。嗅感觉神经元是唯一直接与外界环境相接触,并终身具有再生能力的双极神经元,其特有的再生和分化能力。它的重要意义在于使嗅觉功能的治疗和恢复以及中枢神经系统的移植修复成为可能。本研究通过紫杉醇处理孕鼠,应用免疫荧光、透射电镜和实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-Q-PCR)方法检测β3微管蛋白或嗅标记蛋白(olfactory marker protein,OMP)的表达变化,探讨紫杉醇通过抑制微管蛋白的表达在嗅感觉神经元分化过程中的作用；并通过用神经生长因子(nerve growth factory, NGF)处理孕鼠,初步探讨其对嗅觉的保护作用。材料和方法SPF级小鼠,以雄：雌1:2比例合笼,取查看有阴栓雌鼠30只。随机分为两组,实验组和对照组各15只。实验组给予E0.5天起每日尾静脉注射紫杉醇1ml(浓度为10nmol/L),对照组每日给予生理盐水1ml尾静脉注射。每组再分成E9.5天、E14.5天及E17.5天孕鼠各5只。应用免疫组化、免疫荧光和RT-Q-PCR方法检测β3微管蛋白或嗅标记蛋白的表达变化；应用透射电镜观察嗅细胞形态学变化。应用免疫荧光和RT-Q-PCR方法观察紫杉醇及NGF孕期给药后小鼠嗅黏膜中嗅标记蛋白的表达变化。结果免疫荧光结果显示,在E9.5天嗅基板刚开始发育时可以见到β3的特异性染色,随着孕期的延长,β3微管蛋白的特异性染色明显增多。在E9.5天未见OMP阳性表达,E14.5天可见OMP阳性表达,表达强度小于同期β3微管蛋白,随着孕期的延长,OMP的特异性染色明显增多。紫杉醇处理后,β3微管蛋白和OMP的表达明显弱于正常对照组,但随着孕期的延长,β3微管蛋白和OMP的表达也是逐渐增多。RT-Q-PCR检测的OMP表达结果与免疫荧光结果相同。透射电镜显示紫杉醇处理后,小鼠嗅细胞内结构紊乱,嗅纤毛减少或消失,成空泡样改变。小鼠嗅黏膜免疫荧光染色结果显示紫杉醇处理组β3微管蛋白和OMP表达减少,而NGF给药后,两者表达有所增强,和RT-Q-PCR结果相同。讨论微管作为细胞骨架的重要组成部分,与细胞形态的维持、细胞内物质的运输、细胞运动及细胞分裂增殖等生命活动密切相关。目前在真核生物中已经确定的微管蛋白有7种,分别称为α、β、γ、δ、ε、ζ和η微管蛋白。β微管蛋白由455个氨基酸残基组成。根据C末端的10-15个氨基酸残基不同将β微管蛋白分为7种β同型(β1、β2、β3、β4a、β4b、β5、β6)。这些β微管蛋白同型同属于一个高度同源的蛋白家族,其中β3微管蛋白是特异性酪氨酸磷酸化,在神经发生早期即有表达的唯一微管异构形式而常用于标志干细胞的神经分化。β3微管蛋白的表达起始于神经母细胞有丝分裂中期或末期,在成熟及未成熟的嗅感觉神经元中都有表达。嗅感觉神经元位于嗅上皮的中间层,构成上皮的绝大部分,是气味识别的起始结构,顶层为单层的支持细胞,底层是靠近基底膜的基底细胞,分为2种亚型：水平基底细胞和球形基底细胞。本实验采用常规化疗剂量的紫杉醇和常规治疗剂量的NGF处理孕鼠,干扰微管蛋白的形成,探讨其在嗅感觉神经元的分化过程中的作用。结果显示,在E9.5天嗅基板刚开始发育时可以见到β3的表达,但在E9.5天未见OMP阳性表达,提示嗅感觉神经元前体在嗅基板发育早期即开始形成,但未形成成熟细胞。随着孕期的延长,β3微管蛋白的表达明显增多。E14.5天可见OMP阳性表达,提示胚胎中期出现成熟的嗅感觉神经元,但其表达强度小于同期β3微管蛋白,提示此时期还有一定量的前体细胞存在。随着孕期的延长,OMP的表达明显增多,提示嗅感觉神经元随着胚胎的逐渐成长,不断分化成熟。紫杉醇处理后,β3微管蛋白和OMP的表达明显弱于正常对照组,提示紫杉醇通过抑制微管蛋白的解聚,使微管束不能与微管组织中心相互连接,抑制纺锤体的正常形成,由此抑制了神经元的轴浆运输,阻碍了嗅感觉神经元的发育成熟。但随着孕期的延长,β3微管蛋白和OMP的表达也是逐渐增多,说明紫杉醇并不能完全使嗅感觉神经元分化和发育停滞。NGF通过促进神经系统的发育,维持神经元的生长、存活、分化,并影响突触的可塑性。病理状态下,通过诱导神经生长因子基因的表达,抑制神经元的死亡加强自由基的清除,促进神经元功能的恢复,达到保护神经元的目的。实验结果显示NGF给药后紫杉醇处理组β3微管蛋白和OMP表达有所增加,提示NGF对紫杉醇导致的嗅觉功能障碍有一定的保护作用。结论1、β3微管蛋白在小鼠胚胎发育早期就有表达,随着胚胎的发育成熟,其的表达明显增强。2、嗅感觉神经元在小鼠胚胎发育早期无表达,在胚胎中期出现表达,且随着胚胎的发育成熟,其表达明显增强。3、紫杉醇通过作用于微管蛋白,抑制嗅感觉神经元的分化,阻碍其发育,但不能使发育完全停滞。4、神经生长因子对紫杉醇所致的小鼠嗅感觉神经元损伤有一定的保护作用。