论文部分内容阅读
目的: 通过观察痛泻要方对RIN-m细胞TRPA1表达及Caco-2细胞SERT、5-HTR1A和5-HTR7表达以及两种细胞上清5-HT浓度的影响，探讨痛泻要方对肠道5-HT分泌和摄取的影响和作用机制。 方法: 第一部分:体外培养RIN-m细胞，对照组加入不含药物的RPMI-1640完全培养基，阳性对照组加入浓度为0.5μ g/mL钌红的RPMI-1640完全培养基，痛泻要方低(0.05％)、中(0.1％)、高浓度组(0.5％)分别加入含相应浓度痛泻要方的RPMI-1640完全培养基，在静息与激活状态下，分别培养48与72h，收集各组上清液及细胞，用HPLC法检测5-HT浓度，Real time PCR及Western blot法检测TRPA1表达。 第二部分:体外培养Caco-2细胞，空白对照组加入MEM完全培养基，痛泻要方低(0.05％)、中(0.1％)、高浓度组(0.5％)分别加入含相应浓度痛泻要方MEM培养基，在静息与抑制状态下，分别培养48与72h，收集各组上清液及细胞，用HPLC法检测5-HT浓度，Real time PCR及Western blot法检测SERT表达。 第三部分:体外培养Caco-2细胞，细胞培养方法同上，静息状态下，空白对照组加入不含药物的MEM完全培养基，痛泻要方低(0.1％)、中(0.25％)、高浓度组(0.5％)组分别加入含相应浓度痛泻要方的MEM完全培养基，分别培养48、72h，收集各组上清液及细胞，用HPLC法检测5-HT，Real time PCR及Western blot法检测5-HTR1A及5-HTR7表达，根据5-HT浓度确定痛泻要方最佳工作浓度。5-HTR1A或5-HTR7抑制状态下，空白对照组:加入2mL不含药物MEM完全培养基;抑制状态对照组:分别加入2mL含有100nM的(s)-way-100135或100nMAS19的完全培养基与细胞共孵育90min后，更换2mLMEM完全培养基;阳性对照组:加入2ml含有100nM的(s)-way-100135和50nM的8-OH-PIPAT或100nM AS19和0.5nMSB269970的培养基与细胞共孵育90min后，更换2ml含有50nM的8-OH-PIPAT或0.5nM SB269970的MEM完全培养基;痛泻要方组加入2ml含有100nM的(s)-way-100135或100nM AS19和相应浓度痛泻要方的培养基与细胞共孵育90min后，更换2ml含有相应浓度痛泻要方的MEM完全培养基;继续培养48、72h，干预结束，收集各组上清液及细胞，用HPLC法检测5-HT，Real time PCR及Western blot法检测5-HTR1A及5-HTR7表达。 结果: 第一部分: (1)在静息与激活状态下，与空白对照组比较，各组5-HT分泌量、TRPA1 mRNA与TRPA1蛋白表达均降低，P＜0.05; (2)培养72h和48h比较，各组5-HT分泌量、TRPA1 mRNA与TRPA1蛋白表达均升高，P＜0.05; (3)与阳性对照组比较，痛泻要方各剂量组5-HT分泌量、TRPA1 mRNA与TRPA1蛋白表达均升高，P＜0.05。 (4)在一定时间内，TRPA1表达与5-HT分泌呈正相关，P＜0.01。 第二部分: (1)在静息与抑制状态下，与空白对照组比较，各组5-HT含量均降低、SERT mRNA与SERT蛋白表达均升高，P＜0.05; (2)痛泻药方不同剂量组间比较，低剂量组，中剂量组，高剂量组中SERT mRNA和蛋白表达逐渐升高，P＜0.05; (3)SERT表达与5-HT含量呈负相关，P＜0.01。 第三部分: (1)在静息状态下，与空白对照组比较，痛泻要方组5-HT含量均降低，5-HTR1A mRNA和蛋白的表达明显升高，而5-HTR7 mRNA和蛋白表达明显降低，P＜0.05。 (2)在5-HTR1A抑制状态下，与空白对照组比较，抑制状态对照组5-HT含量升高，5-HTR1A mRNA和蛋白表达降低，5-HTR7 mRNA和蛋白的表达增加;阳性药对照组和痛泻要方组5-HT含量均降低，5-HTR1A mRNA和蛋白表达均升高，而5-HTR7 mRNA和蛋白表达均降低，P＜0.05。 (3)在5-HTR7抑制状态下，与空白对照组比较，抑制状态对照组和痛泻要方组5-HT含量明显降低，5-HTR7 mRNA和蛋白表达降低，而5-HTR1A mRNA和蛋白表达增高;阳性对照组5-HT含量升高，5-HTR7 mRNA和蛋白表达增高，而5-HTR1A mRNA和蛋白表达降低，P＜0.05。 (4)5-HT含量与5-HTR1A表达呈负相关，而与5-HTR7表达呈正相关，P＜0.05。 结论: 1、痛泻要方可以降低RIN-m细胞分泌5-HT和减少Caco-2细胞外液5-HT含量 2、痛泻要方可能通过降低RIN-m细胞上TRPA1表达以减少其分泌5-HT。 3、痛泻要方可能通过调节Caco-2细胞上5-HTR1A和5-HTR7表达增强SERT摄取5-HT，以降低Caco-2细胞外液5-HT含量。