矽肺（又称硅肺）,是由于长期吸入大量含有游离二氧化硅（silicon dioxide,SiO₂）粉尘所引起的以肺部广泛的结节性纤维化为主的慢性进行性职业病。矽肺目前已经成为我国重大的职业卫生安全问题之一。研究矽肺的发生、发展机制,探求有效的治疗靶点一直是世界范围内职业病研究领域的难点和热点问题。肺泡Ⅱ型上皮细胞被认为是肺泡的“防御细胞”,肺泡Ⅱ型上皮细胞的功能状态是决定肺损伤病理转归的决定因素之一。然而,矽肺纤维化过程中,SiO₂刺激对肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用及其机制仍需进一步的深入研究与探讨。N-乙酰-丝氨酰-天门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,Ac-SDKP）一种具有生理活性的内源性四肽。研究发现,Ac-SDKP在其基础分泌水平就有抑制器官内胶原积聚的重要作用。课题组前期研究结果显示,Ac-SDKP可通过抑制成纤维细胞增殖以及肌成纤维细胞分化进而发挥抗矽肺纤维化的作用。本研究拟探讨SiO₂对肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的刺激作用及其机制,进一步观察Ac-SDKP能否通过抑制SiO₂诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡进而发挥抗矽肺纤维化作用,探讨Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用的分子机制。研究共分为三个部分:第一部分SiO₂对人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的刺激作用及其机制目的:以人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为研究对象,观察与分析SiO₂对人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的刺激作用及其机制方法:1将人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549分为:1)对照组;2)SiO₂（50μg/cm²）刺激组。2采用透射电镜观察比较正常对照组及SiO₂刺激组A549细胞超微结构改变及凋亡现象的产生。3提取对照组及SiO₂刺激组蛋白样品,经双向凝胶电泳分离后采用考马斯亮蓝染色显示蛋白点,用ImageMaster 6.0图像分析软件对凝胶进行分析,筛选出差异蛋白。以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术获得肽质量指纹谱并对蛋白质进行分析。4采用Western blot检测A549细胞中GRP78、CHOP以及Caspase-12的蛋白表达。结果:1.透射电镜观察,可见对照组A549细胞细胞膜表面完整,可见微绒毛,胞质密度均匀,无空泡,细胞器完整,染色质均匀,核仁清晰。SiO₂刺激组A549细胞,细胞表面微绒毛减少,内质网扩张,胞浆空泡化,核固缩,染色质高度浓缩向核膜边集。2.经蛋白组学技术筛选出的差异蛋白点中,与对照组相比,SiO₂刺激组有5个蛋白点表达上调,6个蛋白点表达下调。其中内质网应激的标志性蛋白——GRP78表达上调。3.Western blot结果显示,与对照组相比,SiO₂刺激3 h后,GRP78蛋白水平显著增加（P<0.01）。CHOP和Caspase-12蛋白水平在SiO₂刺激6 h至48h之内持续增加,具有时间依赖性（P<0.01）。第二部分Ac-SDKP对内质网应激的调节在抑制二氧化硅诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中的作用及其机制目的:以人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为研究对象,观察Ac-SDKP对SiO₂诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞内质网应激的调节作用,探讨Ac-SDKP抑制SiO₂诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的作用机理。方法:1将人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549分为:1)对照组;2)SiO₂（50μg/cm²）刺激组;3)4-PBA（0.5mmol/L）处理组4)Ac-SDKP(10^-8mol/L)处理组。2采用透射电镜观察Ac-SDKP及4-PBA对SiO₂刺激的A549细胞超微结构的影响。3采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色法检测Ac-SDKP及4-PBA对SiO₂刺激的A549细胞凋亡的影响。4免疫细胞化学染色法检测Ac-SDKP及4-PBA对SiO₂刺激的A549细胞GRP78、CHOP以及Caspase-12蛋白表达的调节作用。5采用Western blot法检测Ac-SDKP及4-PBA对SiO₂刺激的A549细胞GRP78、phospho-PERK、phospho-eIF2α、CHOP以及Caspase-12蛋白表达的影响。结果:1.透射电镜观察可见,Ac-SDKP、4-PBA的预处理显著改善了Si O₂诱导的内质网扩张程度,无明显胞浆空泡化,核固缩以及染色质浓缩现象。2.流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色结果显示,与对照组相比,Si O₂刺激后的细胞早期凋亡率和晚期凋亡/坏死细胞比例明显高于对照组,Ac-SDKP、4-PBA的预处理显著降低了SiO₂诱导的A549细胞凋亡。Ac-SDKP处理组和4-PBA处理组细胞早期凋亡率分别为9.01%和9.52%,晚期凋亡/坏死细胞比例分别为3.09%和3.75%。3.免疫细胞化学染色结果显示,与对照组相比,SiO₂刺激48h后,GRP78、CHOP和Caspase-12阳性细胞数显著增多,GRP78主要表达于胞浆内,CHOP及Caspase-12蛋白在细胞浆及细胞核内均有表达。与SiO₂刺激组相比,Ac-SDKP处理组以及4-PBA处理组GRP78、CHOP和Caspase-12蛋白表达阳性细胞显著减少。4.Western blot结果显示,与正常对照组相比,Si O₂刺激组GRP78、phospho-PERK、phospho-eIF2α、CHOP和Caspase-12蛋白表达水平显著高于对照组,Ac-SDKP、4-PBA的预处理显著降低了SiO₂诱导的GRP78、phospho-PERK、phospho-eIF2α、CHOP和Caspase-12蛋白表达水平。第三部分Ac-SDKP对矽肺大鼠内质网应激介导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的抑制作用及其机制目的:通过建立大鼠矽肺动物模型观察矽肺纤维化过程中内质网应激在介导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中的作用,探讨Ac-SDKP对矽肺大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法:1大鼠矽肺模型的建立:采用HOPE-MED8050动式染尘控制系统构建大鼠矽肺模型。动物随机分为对照组及染尘4周、8周、12周、16周、24周、32周组,每组10只。染尘4周、8周、12周、16周组动物染尘至相应时段处死,24周、32周组动物染尘16周后,转为常规条件喂养直至第24周、32周进行处死（模仿矽肺患者脱离染尘环境后矽肺的发生进展情况）。2采用H.E染色、Masson染色法观察不同染尘时间点,肺组织病理形态的改变,分别采用免疫组织化学法、Western blot法检测SP-D、GRP78、CHOP、Caspase-12、phospho-PERK、phospho-eIF2α和I型胶原的蛋白表达及定位。3根据大鼠矽肺模型制备结果,于染尘16周时将动物随机分为1)对照32周组;2)矽肺模型32周组;3)Ac-SDKP治疗组;4)4-PBA治疗组。4采用H.E染色、V.G染色法观察Ac-SDKP及4-PBA对大鼠肺组织病理形态改变的影响。5采用Western blot法检测SP-D、GRP78、CHOP、Caspase-12、phospho-PERK、phospho-eIF2α和I型胶原的蛋白表达变化。6采用透射电镜观察Ac-SDKP及4-PBA对矽肺大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构的影响。7采用免疫荧光染色法检测大鼠肺组织SP-D/GRP78及SP-D/Caspase-12的共表达情况。结果:1.H.E、Masson染色结果显示,对照组肺组织结构清晰,肺泡壁薄,无明显炎细胞浸润。染尘4周可见巨噬细胞进入肺泡腔内;染尘8周时,肺内可出现多个细胞性结节融合成较大的单个矽结节;染尘16周时可出现多个融合的矽结节;染尘24周时细胞纤维性结节形成,至染尘32周时结节区域面积可达50%左右。2.免疫组织化学染色结果显示,染尘4周和8周大鼠肺组织内SP-D、GRP78,CHOP以及Caspase-12阳性表达的肺泡Ⅱ型上皮细胞数量显著高于对照组,染尘12周后,SP-D阳性细胞开始减少。GRP78阳性细胞数量持续增加直至染尘的第24周,24周后GRP78阳性细胞数量无明显变化。CHOP和Caspase-12蛋白表达随着染尘时间的延续持续增加。Western blot蛋白定量结果与免疫组织化学染色结果相一致。此外,Western blot蛋白定量结果还显示随着染尘时间的延长phospho-PERK、phospho-eIF2α表达持续增加。3.H.E、V.G染色结果显示,Ac-SDKP和4-PBA能够减小矽肺大鼠肺组织矽结节面积,减轻了肺内纤维化程度。4.透射电镜观察可见,Ac-SDKP、4-PBA显著减轻了SiO₂诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞内质网扩张程度,无明显胞浆空泡化,核固缩以及染色质浓缩现象。5.Western blot结果显示,Ac-SDKP和4-PBA减轻了大鼠肺组织SP-D、GRP78、CHOP、Caspase-12、phosphor-PERK、phosphor-eIF2α和I型胶原的蛋白表达。结论1.内质网应激参与了SiO₂粉尘刺激诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。2.Ac-SDKP可通过缓解内质网应激引发的Caspase-12和PERK/eIF2α/CHOP通路的激活而抑制Si O₂诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。