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第一部分IL-17B介导RIP3/MLKL通路在急性DVT血管壁损伤中的实验研究[目的]1、通过狭窄法建立小鼠DVT模型,明确RIP3/MLKL通路及其上游调控因子IL-17B是否参与急性DVT后血管壁损伤;2、探索IL-17B与RIP3/MLKL通路和炎症反应之间的调控作用。[方法]1、随机选取42只WT小鼠建立DVT模型,根据是否狭窄IVC及结扎时间将42只WT小鼠随机分为对照组、2h、6h、12h、24h、48h和7d组,每组6只,确定小鼠成栓率;2、将50只WT小鼠随机分为对照组（20只）和DVT组（30只,狭窄IVC组织48h）,48h后取IVC组织检测坏死性凋亡相关蛋白表达;3、随机选取WT小鼠、RIP3基因敲除小鼠（RIP3-/-）和MLKL基因敲除小鼠（MLKL-/-）各6只建立DVT模型,基于Illumina测序平台对小鼠IVC组织进行真核转录组测序分析,寻找差异表达mRNA;4、选取ECV304细胞株,构建OGD细胞模型,检测不同OGD时间（2h、4h、6h、12h、24h）IL-17B表达情况;检测IL-17B干预后,OGD模型细胞中坏死性凋亡通路相关蛋白表达情况;siRNA转染ECV304细胞,检测各组细胞炎症因子表达情况;5、根据是否狭窄IVC及狭窄前给药不同,将WT小鼠分为4组,每组18只:Control组（对照组,不结扎IVC）、DVT组（IVC狭窄）、DVT/IL-17B组（IVC狭窄+狭窄前约30min于尾静脉注射50μg/kg IL-17B）、DVT/Anti-IL-17B组（IVC狭窄+狭窄前约30min于尾静脉注射50μg/kg IL-17B抗体）;6、根据是否给予IL-17B蛋白预处理,将WT小鼠、RIP3-/-小鼠和MLKL-/-小鼠的DVT模型分为6组,即WTDVT组、RIP3-/-DVT组、MLKL-/-DVT组、WT/IL-17B DVT组、RIP3-/-/IL-17B DVT组、MLKL-/-/IL-17B DVT组,每组 18只;所有小鼠都经病理检查确定有无血栓形成,每组6只进行ELISA分析,6只进行免疫组化,6只进行Western blot检测。[结果]1、狭窄法建立小鼠下腔静脉血栓模型,成栓率和血栓面积均随结扎时间延长而增加,于48h成栓率达83.3%,血栓横截面积达峰值;2、测序结果及KEGG通路分析筛选出急性血栓形成下腔静脉组织中IL-17B的差异表达与RIP3/MLKL信号通路显著相关。3、体外实验:（1）OGD组细胞的IL-17B蛋白表达均较对照组增高（均有P<0.05）,OGD2h起IL-17B表达就增高,2-6h内IL-17B的表达出现平台期,12h后再次升高;OGD-2h组的IL-17B蛋白表达和RIP3、MLKL磷酸化水平均较对照组增高（均有P<0.05）;OGD-2h/IL-17B组RIP3和MLKL磷酸化水平均较单纯OGD-2h组增高（均有pP<0.05）;（2）单纯OGD组细胞IL-17B、IL-6、TNF-αmRNA表达均较对照组增高（均有P<0.05）;OGD/IL-17B组各炎症因子均较单纯OGD组增高（均有P<0.05）;siRNA转染OGD/IL-17B组各炎症因子较OGD/IL-17B组下调（均有P<0.05）;4、体内实验:（1）DVT/IL-17B组小鼠RIP3和MLKL蛋白表达及其磷酸化水平均较DVT组高（均有P<0.05）,DVT/Anti-IL-17B组小鼠的相关指标较DVT组下调（均有P<0.05）;无论是否经IL-17B预处理,RIP3-/-小、鼠的MLKL表达无明显变化（均有P>0.05）。与WT小鼠相比,MLKL-/-小鼠的p-RIP3/RIP3比值降低（P<0.05）;（2）WT小鼠DVT组血浆IL-6和TNF-α表达较正常对照组增高（均有P<0.05）;WT小鼠DVT/IL-17B组血浆炎症因子均较单纯DVT组高（均有P<0.05）;RIP3-/-小鼠DVT组与正常对照组相比血浆IL-6和TNF-α的变化不明显（均有P>0.05）,DVT组与DVT/IL-17B组相比血浆炎症因子的变化不明显（均有P>0.05）;MLKL-/-小鼠DVT组与正常对照组相比血浆IL-6和TNF-α的变化不明显（均有P>0.05）,DVT组与DVT/IL-17B组相比血浆炎症因子的变化不明显（均有P>0.05）;（3）各组小鼠血栓形成情况:DVT/IL-17B组血栓的重量和横截面积均较DVT组增加（均有P<0.05）;而DVT/Anti-IL-17B组血栓的重量和横截面积均比DVT组小（均有P<0.05）。此外,无论有无IL-17B预处理,RIP3--小鼠或MLKL-/-小、鼠血栓的重量均较WT小鼠的小（均有P<0.05）。[结论]1、RIP3/MLKL通路参与急性深静脉血栓形成;2、IL-17B能够促进RIP3/MLKL通路的激活,也能促进炎症因子IL-6和TNF-α的分泌,可能通过激活坏死性凋亡通路加重血管壁的炎症损伤;3、IL-17B通过调控RIP3/MLKL通路参与深静脉血栓形成,IL-17B能加重小鼠深静脉血栓形成,而IL-17B抗体干预能显著减轻深静脉血栓形成;4、RIP3/MLKL通路的抑制对急性DVT及其所致的炎症反应具有保护作用。第二部分携IL-17B抗体的靶向声学造影评价急性DVT的实验研究[目的]将携IL-17B的靶向声学造影剂用于DVT模型兔的造影研究,以期用“可视”的超声造影成像定量评价“微观”的血管壁损伤程度。[方法]1、选取70只新西兰兔进行超声造影研究,将实验兔随机分为正常对照组（C组,10只）、假手术组（S组,10只）和DVT组（D组50只,根据狭窄时间又分为D2h、D6h、D24h、D48h组,D48h组20只,其余每组10只）;各组组内又分为普通微泡（MBN）组（C0、S0、D0组）和靶向微泡（MBI）组（C1、S1、D1组）;2、制备携IL-17B抗体的靶向声学造影剂,将其与OGD损伤的ECV304细胞孵育,计算二者的结合率（花环形成率）;3、将构建好的携IL-17B抗体靶向超声造影剂用于实验兔下腔静脉造影研究,比较①各组兔血管壁周围组织灌注超声造影指标（ME、PI、TTP、RS、AUC）,②D0组和D1组血管壁超声造影指标（wME）;4、检测各组兔循环炎症因子表达量及血管壁IL-17B蛋白表达量,分析①血管壁周围组织灌注造影指标与循环炎症因子的相关性,②血管壁超声造影指标与血管壁IL-17B蛋白表达的相关性。[结果]1、超声造影指标:正常对照组与假手术组MBN和MBI微泡各超声造影指标比较,差异均无统计学意义（均有P>0.05）;正常对照组及假手术组分别与DVT组比较,各造影指标差异均有统计学意义（均有P<0.05）;DVT组MBN微泡与MBI微泡相比,ME、AUC、wME差异均有统计学意义（均有P<0.05）;2、花环形成率情况:与对照组相比,OGD组的花环形成率升高,在OGD2h呈现接近100%的形成率;3、血浆炎症因子表达情况:正常对照组和假手术组相比,血浆IL-17B、IL-6和TNF-α表达均无统计学差异（均有P>0.05）,假手术组与DVT组相比,血浆各炎症因子表达差异均有统计学意义（均有P<0.05）;血管壁IL-17B表达情况:正常对照与假手术组比较,血管壁IL-17B表达无统计学差异（P>0.05）;假手术组与DVT组相比,血管壁IL-17B表达有统计学差异（P<0.05）;4、造影指标与炎症因子的相关性分析:ME、PI、RS、AUS与血浆各炎症因子表达均呈正相关,TTP与血浆各炎症因子表达均呈负相关;wME与血管壁IL-17B蛋白表达呈正相关。[结论]1、急性DVT血管周围组织灌注明显增加,且与血浆炎症因子密切相关;2、靶向声学造影技术不仅能评价急性DVT血管周围组织灌注情况,还能评价血管壁损伤情况。