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[目的]骨质疏松（Osteoporosis,OP）是一种骨量减小、骨组织微结构退化,继而致骨脆性增加、骨折风险剧增的系统性骨病,其所致骨折为老年人致畸致死的主要原因之一[1]。全球OP患者约2亿余,平均每3秒便会新发一例OP所致骨折[2]。伴随老龄化加剧,OP患者数量将进一步呈爆发式增长,给国家和社会带来沉重负担。OP发病率高、危害巨大,发病机制却难以揭示,OP越发成为亟待解决的全球性健康难题。因此,不断深入研究OP发病的分子机制对改善人民的生活质量、提高人民的健康寿命,具有极为重要的战略意义。骨髓间充质干细胞（Hone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的成骨分化在其发生发展过程中发挥重要作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）对骨髓间充质干细胞成骨分化起重要作用,而外泌体承载多种lncRNA,因而外泌体可能参与骨髓间充质干细胞的成骨分化调控。本课题拟探究骨质疏松患者血浆外泌体是否携载了调控骨髓间充质干细胞成骨分化的lncRNA,拟明确目的基因lncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化的功能与机制,从而为骨质疏松的精准防治奠定理论基础并提供新思路。[方法]第一部分:提取骨质疏松患者与骨质正常志愿者血浆外泌体,透射电镜观察外泌体形态特征,Western blot检测外泌体标记蛋白CD63、CD81、TSG101的表达,纳米颗粒跟踪分析（Nanosight Analysis,NTA）外泌体粒径大小及分布。外泌体鉴定成功后,提取RNA,通过高通量测序,筛选出差异表达lncRNA;扩大临床样本量,qRT-PCR再次验证lncRNA的表达,筛选出显著高表达目的lncRNA。第二部分:通过基因功能获得与缺失实验,茜素红染色等,验证目的基因lncRNA016908对骨髓间充质干细胞的调控功能;选用高表达lncRNA016908的外泌体孵育骨髓间充质干细胞,验证携载高表达lncRNA 016908的外泌体对骨髓间充质干细胞生物学功能的影响;构建lncRNA 016908过表达载体,合成lncRNA 016908干扰序列siRNA,转染骨髓间充质干细胞,诱导其成骨分化,qRT-PCR、Western blot检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况。过表达骨髓间充质干细胞lncRNA 016908,分析下游mRNA表达谱情况,分析下游蛋白质组表达情况,初探lncRNA 016908可能调控的骨代谢相关信号通路。第三部分:通过核质分离与FISH实验定位目的lncRNA 016908在骨髓间充质干细胞内的定位;采用RNA pull down实验手段,拉取与目的基因lncRNA 016908可能结合的蛋白质,经质谱鉴定后,选取与骨代谢、衰老等相关的目的蛋白质;然后进行RIP实验,反向拉取与目的蛋白结合的RNA,qRT-PCR验证目的基因lncRNA016908的富集情况。通过基因功能获得与缺失实验,茜素红染色等,验证RNA pull down拉到的目的基因真核翻译起始因子 5A2（Eukaryotic translation initiation factor 5A-2,EIF5A2）,是否具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的生物学功能。构建EIF5A2过表达载体,合成EIF5A2干扰序列,转染骨髓间充质干细胞,诱导其成骨分化,qRT-PCR、Western blot检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况。通过挽救实验,验证lncRNA 016908是否通过靶向EIF5A2调控骨髓间充质干细胞成骨分化。过表达lncRNA 016908的同时,沉默EIF5A2,qRT-PCR、Western blot检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况;沉默lncRNA 016908 的同时,过表达 EIF5A2,qRT-PCR、Western blot 检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况。[结果]第一部分:成功获取了大量血浆来源外泌体,经NTA、透射电镜方法以及Western blot检测,其大小、形态、粒径及表面标志物均符合外泌体特征。经高通量测序,筛选到大量差异表达lncRNA,其中lncRNA 016908显著高表达,且经qRT-PCR验证,其稳定高表达于骨质疏松患者血浆外泌体。第二部分:外泌体具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。LncRNA 016908具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能:过表达lncRNA 016908后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2等表达降低,钙沉积减少,骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱;干扰lncRNA 016908表达后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2表达升高,钙沉积增多,骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强。第三部分:LncRNA016908主要定位于骨髓间充质干细胞的细胞核;本课题通过RNA pull down实验,拉取到与目的基因lncRNA 016908结合的蛋白质EIF5A2;进一步通过RIP实验与qRT-PCR检测,反向验证到大量lncRNA 016908富集于EIF5A2。EIF5A2具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能:过表达EIF5A2后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2等表达降低,钙沉积减少,骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱;干扰EIF5A2表达后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2等表达升高,钙沉积增多,骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强。沉默EIF5A2能够挽救过表达lncRNA 016908导致的骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱,从而增强其成骨分化能力;过表达EIF5A2能够逆转沉默lncRNA016908导致的骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强,从而降低其成骨分化能力。[结论]1、携载lncRNA 016908的外泌体具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。2、LncRNA 016908具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。3、EIF5A2具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。4、LncRNA 016908可以通过靶向EIF5A2抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,进而影响骨质疏松发病。