[背景和目的]肺癌是死亡率、发病率较高的恶性肿瘤,每年因患肺癌导致的死亡人数居高不下,目前对于它的发生、发展具体机制尚不清楚,因此进一步深入探讨肺癌发生和发展的机制对进行针对性地诊治有极大好处。区别于国外及国内其他地域的肺癌高发情况,云南省东北部的肺癌高发表现出其自身特点,呈点状极为集中的分布,主要集中的地区是宣威和个旧两个地级市范围,尤其是宣威地区肺癌又是国内乃至全球发病率及死亡率极高的恶性肿瘤,是全球点状区域性高发肺癌研究的代表性地区疾病。所谓宣威肺癌即是高发生率发生在该地区,并在当地出生,居住≥3代的肺癌患者。而“宣威地区”广义上泛指珠江源地区,包括宣威市、麒麟县、富源县、马龙县、沾益县及贵州西南部等地域,位于中国西南部及云南省东北部乌蒙山区,当地富藏铁、铜、煤等矿产资源,拥有人口约310万,土地面积6069.88平方公里,尤其是最为高发的区域为宣威市（距省会昆明市260公里,是云南人口最多的县级市,是属于国内200个主要产煤县市）,包括榕城、靖外、来宾、格宁、热水等14个镇、8个乡、25个居委会和331个行政村,全市人口约129.75万人。因当地煤炭资源丰富,居民习惯就地取材,以当地的烟煤作为主要生活燃料,住宅多为云南地区的传统建筑结构,为一楼一底土木结构,由于无排烟设备系统,室内长期空气流通不畅,燃烧燃料排放的大量烟尘使屋内空气污染严重,这可能和导致宣威肺癌的高发生率的原因息息相关。1975年统计的关于全国肿瘤死亡情况表明,宣威市农民肺部恶性肿瘤致死百分比较高,并且特别显著,从这一发现开始,由此拉开了宣威肺癌研究的序幕,自此宣威肺癌引起了国内及全球研究者的重视。全国三次死因回顾调查显示:宣威地区肺癌死亡百分比从二十世纪70年代以来持续升高。当地市疾控中心资料显示:1990年到1992年,宣威肺癌死亡十万分比为23.14/10万,男、女死亡百分比分别为4倍和8倍于国内平均值。2014年和其后一年,宣威地区肺癌死亡率为9.111/1万,男、女死亡率分别为国内平均死亡率的3倍和6倍,比较两个时间点,后者较90年代又提高近4倍。而就目前对癌症的研究,基因改变是肿瘤发病的一个重要因素,因此,寻找宣威肺癌相关基因同样是了解宣威肺癌的发病机制及深入研究的关键,为其早期诊治的进行提供有效途径。色氨酸-天冬氨酸重复序列及C-末端细胞因子信号传导的抑制因子WSB2（WD repeat and SOCS box containing protein2）根据其特殊结构,将其命名为包含WD 重复序列及SOCS 盒蛋白（WD repeat andSOCS box containing protein,WSB）结构的基因。根据WD基序的数量,WSB又分为WSB1和WSB2。而WD重复序列是指包含多个色氨酸-天冬氨酸基因的重复序列（WD repeat）,SOCS盒又是指一种C-末端的细胞因子信号传导的抑制因子盒（suppressor of cytokine signaling box,SOCS box）。这两种结构在癌症的形成及成长过程中很明显的担任主角,且参与形成多种类型恶性肿瘤,具体机制尚未被明确的确定,有研究认为SOCS盒的蛋白可通过促进ElonginB/C-Cullin2复合物的形成,从而激活了相关的致癌基因并导致肿瘤发生。因WSB2的蛋白质同样也含有SOCS盒结构,所以引起了研究者的关注。本研究的目的:通过TCGA数据库下载肺癌中色氨酸-天冬氨酸重复序列及C-末端细胞因子信号传导的抑制因子WSB2表达情况的数据,分析宣威肺癌患者体内WSB2的表达情况,以及WSB2表达水平与其临床分期与预后相关性。同时利用体内和体外实验研究了 WSB2对宣威肺癌侵袭、增殖、迁移及凋亡方面的影响,探讨了WSB2通过调控Wnt/β-catenin信号通路的功能及其在宣威肺癌中的功能。通过以上研究验证WSB2在宣威肺癌中扮演的角色及其作用机制,以期能够进一步为宣威地区肺癌的防治、诊疗工作拓展新的方法。第一部分WSB2在宣威肺癌组织中的表达及临床意义[目的]分析与检测宣威病例癌组织和正常肺组织中WSB2表达情况。[方法]1.由TCGA表达谱下载肺癌病例中WSB2的表达水平情况,同时筛选出临床资料、生存资料完整和存活期超过2个月的病例,用于分析COX多因素风险模型比例和后续生存曲线。2.收集在昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）胸外一科行手术治疗的宣威肺癌患者癌变部位组织和配对远端正常肺组织样本共42例,苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色对宣威肺癌病理形态进行鉴定;免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色、实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测及免疫印迹（WB,Western Blotting）分析研究宣威肺癌患者病变部位和正常肺组织中WSB2的表达情况。[结果]1.生物信息学分析显示:WSB2在肺鳞癌组织中较腺癌高表达,而且和肺癌的临床分期及预后显著关联（P<0.05）。2.收集昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）胸外一科行手术治疗的宣威肺癌患者癌组织和配对远端正常肺组织样本共42例,采用免疫组织化学染色（IHC）显示:宣威肺癌癌组织中WSB2阳性率高于正常肺组织（83.3%VS.26.2%,p=0.007,<0.01）。3.对上述样本行Western Blotting检测验证宣威肺癌中WSB2蛋白表达水平,数据表明:这些病例癌部位组织中WSB2蛋白表达水平显著比正常肺组织要高（P<0.01）。4.同时对上述样本行q-PCR检测验证患者病变部位癌组织中WSB2基因表达情况,数据表明:宣威肺癌患者病变部位组织中WSB2基因表达水平比正常部位肺组织明显高（P<0.01）。5.对宣威肺癌患者临床基本资料和分期在免疫组化中WSB2的阳性率进行比较,结果显示:分期为Ⅰ期病例的组织样本的阳性率低于ⅢA期,存在统计学差异（P<0.05）。[结论]WSB2在宣威肺癌病变部位组织中呈高表达,其也许在该种肺癌的发生、发展中起着重要作用,宣威肺癌患者的分期和生存率与其表达密切相关。第二部分在宣威肺癌细胞XWLC-05及裸鼠体内WSB2的生物学功能研究[目的]第一部分研究中发现WSB2是在宣威肺癌癌组织中高表达的基因,其蛋白表达升高提示患者预后不良。为证实WSB2在宣威肺癌中恶性生物学行为导致患者出现这一系列临床病理特征,本论文进一步探讨在宣威肺癌细胞系XWLC-05里WSB2与细胞迁移、增殖、凋亡及侵袭的关系,并采用裸鼠移植瘤实验研究WSB2在体内环境下对宣威肺癌的影响。旨在获得WSB2促进宣威肺癌肿瘤发生、发展等恶性进程的可靠证据,为WSB2成为宣威肺癌治疗的新靶标提供科学依据。[方法]1.为了敲减XWLC-05细胞中WSB2基因并使其编码蛋白表达降低,抑制WSB2的表达,本部分研究通过WSB2-shRNA慢病毒干扰载体感染构建WSB2敲减XWLC-05稳转细胞株。2.利用CCK-8法对细胞的增殖进行检测,对细胞凋亡采用流式细胞术进行检测,Transwell转移小室实验和细胞划痕实验对细胞的侵袭和迁移能力进行检测。Western Blotting检测了“EMT”过程相关蛋白的表达水平。3.为进一步验证WSB2在体内对XWLC-05细胞的作用是否与体外一致,本研究采用WSB2敲减的XWLC-05细胞株,构建了裸鼠异种定植瘤模型。对WSB2敲减和XWLC-05细胞成瘤作用影响进行了检测。[结果]1.在宣威肺癌细胞系中,WSB2敲减后显著抑制XWLC-05细胞增殖（P<0.05）2.在宣威肺癌细胞系中,WSB2敲减后细胞凋亡率呈显著上升（P<0.05）;3.宣威肺癌细胞系WSB2敲减后,细胞迁移能力和侵袭性呈显著下调（P<0.05）。4.宣威肺癌细胞系中,WSB2敲减后,N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平显著下降（P<0.01）;E-cadherin的蛋白水平显著升高（P<0.01）。5.裸鼠体内实验中,WSB2敲减后XWLC-05细胞成瘤能力得到明显下降（P<0.05）。[结论]1.下调WSB2能使XWLC-05细胞的迁移、增殖和侵袭能力都骤减,凋亡率明显升高,WSB2扮演着促进宣威肺癌发生、发展及侵袭的角色。2.WSB2在裸鼠体内同样可促进宣威肺癌的生长。第三部分WSB2激活Wnt/β-Catenin信号通路促进宣威肺癌细胞增殖、迁移的机制研究[目的]前面研究中探索出WSB2可能具有刺激宣威肺癌细胞增殖、迁移,抑制凋亡的作用,本部分研究拟采用构建WSB2过表达的XWLC-05稳转细胞株,并同时对照采用Wnt/β-Catenin信号通路阻碍剂FH535作用XWLC-05的细胞,初步探讨WSB2通过Wnt/β-Catenin途径促进宣威肺癌肿瘤细胞增殖、迁移可能的分子机制,旨在为WSB2成为宣威肺癌治疗的新靶标提供科学的理论依据。[方法]构建XWLC-05稳转细胞株,使WSB2处于过表达状态,并采用Wnt/β-Catenin信号通路阻碍剂FH535处理XWLC-05细胞进行对照,同样利用CCK-8法分析细胞增殖,Transwell转移小室实验细胞和划痕实验分析细胞的侵袭和迁移能力。Western Blotting检测了“EMT”过程和Wnt/β-catenin途径相关蛋白表达水平,从而探讨WSB2通过Wnt/β-catenin途径对于宣威肺癌有何功能。[结果]1.WSB2过表达能显著提升XWLC-05细胞增殖、迁移能力和侵袭性（P<0.05）,而Wnt/β-Catenin途径阻碍剂FH535能显著下调WSB2的促进作用（P<0.01）。2.敲降WSB2基因表达水平后,c-Myc和β-Catenin蛋白水平显著降低（P<0.01）;而WSB2基因过表达后,c-Myc和β-Catenin蛋白水平显著升高（P<0.01）。WSB2可以调节Wnt/β-Catenin信号转导中两个关键蛋白c-Myc和β-Catenin的表达情况。3.WSB2过表达后,N-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平显著升高（P<0.01）;E-cadherin的蛋白表达水平显著降低（P<0.01）。抑制剂FH535处理后,N-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平显著降低（P<0.01）;E-cadherin的蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。[结论]1.WSB2通过调节Wnt/β-Catenin信号传导调节宣威肺癌细胞生长和转移。2.WSB2的过度表达也导致Wnt/β-Catenin信号的激活。此外,Wnt/β-Catenin途径的抑制剂FH535能减轻WSB2过度表达引起的宣威肺癌。3.WSB2通过刺激Wnt/β-catenin途径,对宣威肺癌有激发作用,也许可成为宣威肺癌的医治靶标。