研究背景及目的:西青果为诃子属植物诃子Terminalia chebula Retz未木质化的幼果经水烫、晒干后的干燥幼果,具有清热生津,解毒的作用,临床上用于阴虚白喉。目前,对西青果的化学成分及相应生物学效应研究较少,但对其成熟果实诃子的研究较多,研究文献显示诃子果实所含化学成分主要为酚酸类化学成分,这类成分具有抗氧化、抗菌、抗炎等多种生物活性。有文献研究证实,诃子含水乙醇提取物能对抗巨噬细胞源性促炎症细胞因子的表达,具有抗炎活性。体外细胞试验文献也证实,诃子中主要化学成分之一诃黎勒酸具有同时抑制炎症发生过程中的两种关键性酶:5-脂氧合酶(5-LOX)和2-环氧合酶(COX-2)活性的能力,可起到减轻炎症反应的作用。目前,虽然无文献对西青果抗炎活性进行研究,但按照中国药典的规定,西青果所含水溶性浸出物比其成熟果实诃子高出50%,提示西青果中类似化学成分可能亦具一定抗炎活性,值得进一步探讨。为此,我们进行了本项研究。本文探讨了西青果抗炎活性成分的提取、分离和鉴定,并在细胞水平和整体动物水平对其主要成分柯子宁(Chebulanin)的抗炎作用进行研究,为阐明西青果药效物质及作用机理奠定了基础。实验方法及实验结果:第一部分西青果抗炎活性成分的分离及结构鉴定实验方法1.西青果总酚酸类化合物的提取西青果药材粗粉经70%丙酮浸渍提取3次;提取液减压浓缩(控制温度不高于50℃)至无丙酮味。浓缩液适量,先用苯萃取3次,下层药液用乙酸乙酯多次萃取,合并乙酸乙酯,减压浓缩(控制温度不高于50℃),得黄褐色固体。2.西青果总酚酸类成分的HPLC检测色谱柱为Ultimate LP-C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇(流动相A)和0.6%磷酸(流动相B),在流速1.2m L/min,检测波长278nm,柱温40℃的条件下进行梯度洗脱。3.西青果酚酸类化合物的分离取西青果总酚酸类粗提物60g,用蒸馏水溶解,固液分离,溶液缓慢加入处理好的大孔吸附树脂柱,控制流速约15ml/min;剩余固体物继续用蒸馏水溶解,固液分离,溶液上样于大孔吸附树脂柱。多次操作,至固体物基本不能溶解在水中,水溶出液全部上样于大孔吸附树脂柱。依次用0%-90%甲醇洗脱,每250m L流出液收集一瓶,与1%酸性Fe Cl3溶液颜色反应,初步判断是否含有酚酸类物质。为了进一步确定成份,将流出液减压浓缩(控制温度不高于50℃)至固体,甲醇溶解后用HPLC检测。根据流出液中酚酸类物质的种类,将种类一致的洗脱液合并,减压浓缩(控制温度不高于50℃)至固体,用50m L甲醇溶解后,置于阴凉处自然析晶。根据HPLC色谱图判断是否需要重结晶。有结晶物析出的层析流出物部分,滤取结晶物,真空干燥器中干燥,备用。4.单体化合物的结构鉴定根据对单体化合物的初步判断,采用熔点测定、UV、IR、MS和NMR等方法,与已知对照品对照,最终完成单体化合物的鉴定。实验结果1.总酚酸类提取物色谱图在西青果总酚酸类提取物色谱图中,用对照品进行对照,确定了部分色谱峰的归属,依次为没食子酸(tR7.45min)、柯里拉京(tR20.59min)、柯子宁(tR21.53min)、诃黎勒酸(tR29.76min)、诃子酸(tR37.25min)。2.大孔吸附树脂柱分离结果西青果总酚酸类提取物经大孔吸附树脂柱分离,合并洗脱液,得到了化合物Ⅰ(白色针状结晶)、化合物Ⅱ(白色粉末状固体)、化合物Ⅲ(类白色无定形粉末)和化合物Ⅳ(白色片状结晶)。3.单体化合物的结构鉴定结果分离得到的四种化合物单体成分,根据HPLC、UV、IR、MS和NMR技术的检测结果,结合对照品色谱及化合物光谱文献数据,确定了单体结构,分别为:没食子酸、柯子宁、诃黎勒酸和诃子酸。第二部分西青果提取物柯子宁抑制LPS对单核/巨噬细胞炎症信号通路及细胞因子的作用研究实验方法1.不同浓度柯子宁对RAW264.7细胞生长的影响配制系列浓度的柯子宁溶液(1000μM,500μM,200μM,100μM,50μM,10μM,1μM)以及阳性对照药地塞米松溶液(10μM,5μM,1μM,0.5μM,0.1μM,0.01μM,0.001μM)。细胞培养24小时后,换成以上含药物培养基于37℃,5%CO2培养箱继续培养24小时。按照CCK8说明书测定450nm处的吸光度,计算抑制率。阴性对照组为PBS,每个浓度设置3个复孔。抑制率(%)=(1-T/C)x 100%,其中T表示实验孔的吸光度,C表示对照孔的吸光度。2.Real-time PCR法测定柯子宁对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子m RNA水平的影响5x105个RAW264.7细胞接种于12孔板,过夜培养12小时后,每孔加入不同浓度的柯子宁(终浓度分别为100μM,50μM,10μM),0.5μM的地塞米松作为阳性对照,PBS作为阴性对照,于37℃,5%CO2培养箱中孵育2小时。以100ng/m L的LPS刺激细胞20小时后,收集细胞提取m RNA,行RT-PCR检测细胞炎症因子TNF-α、COX-2的m RNA表达情况。每个样本均设三个复孔。3.ELISA法测定柯子宁对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子分泌的影响0.5x105个RAW264.7细胞接种于24孔板,过夜培养12小时后,每孔加入不同浓度的柯子宁(终浓度分别为100μM,50μM,10μM),0.5μM的地塞米松作为阳性对照,PBS作为阴性对照,于37℃,5%CO2培养箱中孵育2小时。以100ng/m L的LPS刺激细胞24小时后,收集上清液,行ELISA检测细胞炎症因子TNF-α、IL-6的表达情况。每个样本均设三个复孔。4.Western Blot法检测柯子宁对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB信号通路磷酸化水平的影响2x105个RAW264.7细胞接种于6孔板,过夜培养12小时后,每孔加入不同浓度的柯子宁(终浓度分别为100μM、50μM、10μM),PBS作为阴性对照。37℃,5%CO2培养箱中孵育1小时后,以100ng/m L的LPS刺激细胞3小时。收集细胞提取总蛋白,行western blot检测磷酸化NF-KB p65蛋白的表达情况。每个样本均设三个复孔。实验结果1.柯子宁对RAW264.7细胞体外增殖的影响柯子宁在100μM以下,地塞米松在0.5μM以下时,抑制率小于10%,在显微镜下观察细胞形态没有明显变化,与空白对照组相比无显著性差异(p<0.05)。因此,最后确定柯子宁使用100μM,地塞米松使用0.5μM,作为后续实验的最大药物浓度。2.柯子宁对RAW264.7细胞炎症因子m RNA表达水平的影响0.5μM地塞米松可以显著性降低TNF-a和COX-2 m RNA的水平,可以作为阳性对照。100μM、50μM以及10μM的柯子宁均能够显著降低LPS诱导的炎症因子TNF-a的m RNA水平(P<0.01),且呈比较明显的浓度依赖效应。对于COX-2 m RNA水平变化,有着相同的趋势,即100μM、50μM和10μM的柯子宁预处理细胞,能够以一种浓度依赖性的方式显著降低COX-2 m RNA水平(P<0.01)。3.柯子宁对RAW264.7细胞炎症因子表达水平的影响0.5μM地塞米松可以显著性降低TNF-a和IL-6的表达水平,可以作为阳性对照((p<0.01);100μM、50μM、10μM的柯子宁均能降低TNF-a的蛋白表达水平(p<0.01);对于IL-6的表达,100μM和50μM柯子宁具有显著性的抑制效果(p<0.01)。4.柯子宁对RAW264.7细胞NF-κB信号通路磷酸化水平的影响Western blotting结果显示,与阳性组(LPS)相比,10μM,50μM和100μM的柯子宁预处理细胞后,细胞磷酸化的NF-κB p65蛋白含量都呈现降低趋势,并呈现浓度依赖性。第三部分西青果提取物柯子宁治疗关节炎模型小鼠的药效及机制研究实验方法1.胶原蛋白诱导性关节炎(CIA)动物模型的制备DBA/1小鼠按Brand等报道的方法造模,经初次免疫诱导剂初次免疫、加强免疫诱导剂加强免疫,制备CIA动物模型。2.柯子宁对胶原诱导关节炎小鼠的治疗将30只SPF级DBA/1雄性小鼠(6周,18±2g)随机分为五组,分别为对照组,模型组(CIA),低剂量组(柯子宁,40mg/kg)、中剂量组(柯子宁,80mg/kg)和高剂量组(柯子宁,160mg/kg);对照组和模型组灌胃给药,模型组给予低、中、高三个剂量的柯子宁溶液(柯子宁溶解于1%羧甲基纤维素);从初次免疫第39天(全部发病)开始给药,每天一次,持续28天,给药完成后继续观察2周,于初次免疫第80天断颈处死小鼠,取双侧踝关节及足趾关节,用于Micro-CT扫描、病理切片。3.体征观察及关节炎程度评分每天观察各组小鼠饮食、活动及毛发改变,每周两次采用文献标准进行关节炎评分。4.Micro-CT影像学检测选取小鼠右后肢,使用Viva 40 Micro CT仪对小鼠关节进行扫描并3D重建;采用SIPL软件将骨组织与软组织区分;同时,分析骨密度(BS)骨表面积/骨密度(BS/BV)和骨小梁厚度(Tb.Th)。5.关节病理形态学检查取关节标本,经脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色制片后,用光学显微镜观察足祉关节及裸关节周围炎症,血管鼓形成、滑膜增生及软骨下骨质破坏程度,并进行评分。6.免疫组织化学检测取关节标本,经选片制片、脱蜡、水化、抗原微波修复、阻断内源性过氧化物酶活性、血清封闭、孵育一抗、孵育二抗、辣根过氧化物酶处理、DAB显色、复染、脱水、封片制片,光镜观察,进行免疫组化评分。实验结果1.CIA小鼠临床表现经小鼠关节炎指数评价,初次免疫无任何小鼠发展为关节炎;加强免疫(第21天)后第二天即有小鼠开始出现关节炎症,至初次免疫第35天左右,实验组24只小鼠全部发展为关节炎,造模率100%。2.高中剂量柯子宁能有效缓解CIA诱导的关节炎症结果显示,给药28天以后,中剂量组和高剂量组与模型组比,能显著降低关节炎指数,差异有统计学意义(p<0.05)。但低剂量组与模型组比,效果不明显。治疗结束后观察两周,结果显示,高剂量和中剂量组小鼠炎症指数维持在5-6分水平,与模型组(11分)比有显著差异(p<0.05)。低剂量组小鼠炎症仍比较严重(9-10分),症状未得到明显改善。3.Micro-CT影像学检测三维重建图中可以看出,柯子宁中剂量组和高剂量组治疗后小鼠骨表面侵蚀程度得到显著缓解和改善。相关参数值BV,BS/BV以及Tb.Th的结果显示,发病早期即给予柯子宁治疗的小鼠与正常小鼠相比,仍有一定的骨损失,但与模型组相比,体积明显增加,骨小梁厚度也明显增厚。4.病理切片观察病理切片HE染色结果显示,柯子宁低剂量组关节囊组织可见有一定破坏,滑膜及滑膜下组织间有少量炎症细胞的浸润,关节腔变窄。经关节组织病理学评分显示,与模型组相比,柯子宁中剂量组和高剂量组的关节组织病理学评分显著降低。5.柯子宁对炎症因子TNF-α和IL-6表达的影响柯子宁治疗组中,低剂量组TNF-α、IL-6的表达仍比较明显,但高、中剂量组TNF-α、IL-6的表达显著降低,与模型组有显著性差异(p<0.05)。6.柯子宁对COX-2以及MMP-3表达的影响柯子宁治疗组中,低剂量组COX-2及MMP-3的表达仍比较明显,但高、中剂量组COX-2及MMP-3的表达显著降低,与模型组有显著性差异(p<0.05)。结论:1.利用含水丙酮冷浸提取、低温浓缩回收丙酮、乙酸乙酯萃取和低温浓缩的方法得到酚酸提取物。利用大孔吸附树脂等分离方法,对西青果酚酸提取物进行分离、纯化,得到酚酸类化合物单体,并对其进行结构鉴定。最终获得四种单体:没食子酸(Gallic acid)、柯子宁(Chebulanin)、诃黎勒酸(Chebulagic acid)和诃子酸(Chebulinic acid)。2.RAW264.7细胞实验显示,柯子宁可显著抑制LPS诱导的炎症因子TNF-a m RNA水平,和TNF-a和IL-6蛋白表达水平;也可以显著性抑制炎症关键酶COX-2 m RNA水平。同时,柯子宁可以降低LPS诱导的磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平,这提示柯子宁可能通过NF-κB信号通路来抑制由LPS诱导的炎症反应。3.构建胶原蛋白诱导性关节炎动物(CIA)模型,考察柯子宁对类风湿性关节炎的治疗作用及关节组织中炎症因子的表达。结果显示,柯子宁可显著缓解小鼠关节炎症状,降低关节评分;并能显著下调关节组织中TNF-α、IL-6、COX-2和MMP-3等炎性介质的表达。