论文部分内容阅读
开花是高等植物延续后代的一个非常重要的过程。研究表明编码磷脂酰乙醇胺结合蛋白的PEBP基因家族成员在高等植物中对开花转变的调控起着关键的作用。橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)属于大戟科多年生木本植物,是目前7500多种产胶植物中最重要的天然橡胶生产者。橡胶树高产、优质、抗病、抗逆境胁迫新品种的选育一直以来都依赖于传统的杂交育种,但由于橡胶树生长缓慢,从胚后发育的童期到开花需要很多年的时间,而且有些性状只有在成年期才能表现出来,这将严重阻碍橡胶树育种的进程。因此,分子手段的实施对新品种选育和改良、缩短育种进程将起到非常重要的作用。在本研究中,橡胶树PEBP基因家族成员的克隆及其生物学功能的研究和探索,明确其在橡胶树开花转变过程中的作用,为利用分子育种技术加快橡胶树新品的培育奠定基础。我们的研究结果主要有以下几方面:1.我们从橡胶树中一共克隆了 8个PEBP基因家族成员,分别命名为HbFT1、HbFT2、HbTFL1-1、HbTFL1-2、HbTFL1-3、HbCEN1、HbCEN2 和 HbMFT1。除了HbCEN1基因以外(它包含4个外显子和4个内含子),其余7个成员皆拥有保守的基因组结构特征,包括4个外显子和3个内含子。蛋白质进化树分析表明,HbFT1和 HbFT2 属于 FT-like 亚家族;HbTFL1-1、HbTFL1-2、HbTFL1-3 以及 HbCEN1 和HbCEN2 属于 TFL1/CEN-like 亚家族;HbMFT1 属于 MFT-like 亚家族。2.荧光定量分析显示,8个基因表现出不同的时空表达模式,其中HbMFT1主要在胚状体中表达;HbFT1主要在成年树的稳定叶片中表达;HbFT2主要在成年树繁殖器官中表达;HbTFL1-1主要在3个月幼苗的根及不同年龄阶段的稳定叶中表达;HbTFL1-2主要在3个月幼苗的根中表达;HbTFL1-3主要在3个月顶端分生组织及开花的雄花中表达;HbCEN1和HbCEN2主要在在各个发育阶段的茎和顶端分生组织中表达。在花序发育过程中,HbTFL1-1、HbTFL1-2和HbTFL1-3的表达量随着花序的发育逐渐上升,而HbCEN1和HbCEN2则相反,它们的表达量随着花序的发育逐渐降低,尤其是HbCEN2,其表达量在开花的花序中几乎检测不到。这些结果说明8个PEBP基因家族成员在橡胶树中有着不同的生物学功能。3.2个FT-like基因在不同龄树稳定叶中的不同月份荧光定量表达分析显示,同一个基因在不同树龄中的表达模式相似,且表达量都随着年龄的增加而升高。但两者间的表达模式却不相同,在主花期3-5月份HbFT1基因表达量极低,而9月和10月为其表达高峰期,HbFT2基因表达量在3月份最高,其次是6、7及11月份。4.3个月幼苗的稳定叶经不同光周期处理后,HbMFT1、HbFT1和HbFT2的表达量在长日照条件下都很低,而在短日照环境中却被强烈诱导,但三者表现出不同的表达模式,其中HbMFT1基因的表达在光照出现时(即8点)最高,HbFT1则表现出两个表达高峰,一个在中午12点,另一个在凌晨6点,而HbFT2则在晚上10点出现表达高峰。此外,不同温度梯度处理后,三者在28℃时表达最高。5.为了研究PEBP家族成员的生物学功能,我们分别构建了由35S启动子启动目标基因的过表达植物表达载体,并分别转化野生型拟南芥。结果显示,与wt相比,HbMFT1转基因拟南芥种子萌发、根系和地上部分的生长发育以及开花转变都受到了明显的抑制。5个TFL1/CEN-like基因的野生型转基因植株生长发育及形态建成受到影响,主要表现在营养生长期被延长从而延迟了开花转变,与此同时,花器官和角果不同程度地表现出畸形,而且每个基因的过表达都会导致部分不开花转基因株系的出现。2个FT-like基因的转基因植株则表现出过度早花表型,并伴有终端花序的形成。6.5个TFL1/CEN-like基因和2个FT-like基因的植物表达载体分别转化tfl1-1和ft-10突变体拟南芥,结果显示5个TFL1/CEN-like基因的tfl1-1突变体转基因植株都分别出现了部分转基因株系与wt类似的表型,更有甚者还有过度晚花及不开花株系的出现。2个FT-like基因的ft-10突变体转基因株系中都分别出现了一些类似wt表型的株系,还有一些开花时间比wt还要早。7.我们分别克隆了 8个基因的启动子,构建了植物表达载体(除了HbCEN2启动子以外)并将它们分别转化拟南芥,结果显示,转基因植株GUS活性部位与启动子组织表达元件类型基本吻合,但比在橡胶树中的组织表达分布要广,据此我们推测克隆的这些基因启动子部分元件在橡胶树中可能受到上游调控元件的抑制。此外,HbMFT1启动子在转基因拟南芥中受到ABA的诱导。根据以上实验结果,我们推测HbMFT1可能主要参与胚状体的发育,但负调控种子萌发、植株生长发育及开花诱导;5个TFL1/CEN-like基因可能参与维持童期或者营养生长;HbFT1虽然具有促进转基因拟南芥开花的功能,但在橡胶树中可能参与其他的方面的调控,比如芽的休眠、叶片衰老等;而HbFT2可能是橡胶开花促进者。