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研究背景MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内,并在细胞增殖、分化、转化及凋亡等过程中具有至关重要的作用。RAS-RAF-MEK-ERK信号通路涉及了多个癌基因的激活,与恶性肿瘤的发生密切相关。研究发现,在人类多种肿瘤组织中均存在B-RAF突变(如70%的皮肤癌、50%的甲状腺癌等),其中约90%的点突变为T1799A,导致该位点缬氨酸被谷氨酸所替代(V600E),成为B-RafV600E。作者导师前期鉴定出癌基因B-RafV600E新的作用底物——Mps1。B-RafV600E主要通过磷酸化修饰Mps1来增强Mps1蛋白稳定性,使Mps1蛋白表达增加,从而导致中心体过度复制、纺锤体检测点过度激活以及染色体不稳定性。但是,癌基因B-RafV600E对Mps1蛋白表达在黑色素瘤细胞中的调控机制还不完全清楚。研究目的明确B-RAF基因对Mps1蛋白表达在黑色素瘤细胞中的调控作用及机制。研究方法(1)我们构建四种过表达质粒：pBabe-puro-GST-B-RafWT pBabe-puro-GST-B-Rafv600E, pBabe-puro-GFP-Mps1-WT和pBabe-puro-GFP-Mps1-KD(Mpsl激酶失活突变体),通过标准磷酸钙转染法在HEK293T细胞中制备逆转录病毒,单独或联合感染不同的黑色素瘤细胞系。(2)设计B-RAF敲除序列：(BEl1,AAAGAATTGGATCTGGATCAT)和(BE3, AAGCTAGATGCACTCCAACAA),利用Lip2000将其转染入不同的黑色素瘤细胞中。(3)构建Mps1敲除载体pSUPER.retro-siMps1,通过标准磷酸钙转染法在HEK293T细胞中制备逆转录病毒,感染不同的黑色素瘤细胞系。(4)收集上述转染48小时后的目的细胞裂解,应用Western-blot方法来检测各种蛋白(Mpsl、B-RafWT、p-ERK)的表达水平。研究结果(1)在B-RafWT和B-RafV600E细胞系中分别敲除B-Raf、抑制B-Raf激酶活性或者抑制MEK均可导致Mpsl蛋白水平显著性减少,提示在黑色素瘤细胞中, Mps1的表达依赖于B-RafMEKERK信号通路。(2)在B-RafWT细胞系中,表达外源性Mpsl-WT, ERK活性降低；而敲除内源性Mps1,ERK活性增强。提示Mps1激酶对B-RafWTMEKERK通路存在负反馈调控作用。(3)在B-RafwT细胞系中,过表达Mpsl-WT或Mps1-KD, ERK活性均降低。提示Mps1对B-RafMEKERK通路的抑制作用不依赖于它的激酶活性。(4)在B-Ra,600E细胞系中,表达外源性Mps1, ERK活性几乎不发生变化；进一步敲除内源性Mps1,ERK活性也同样不发生变化。提示癌基因B-RafV600E对上述Mps1激酶和B-RafERK通路之间的负反馈通路有抵抗作用。结论综合以上结果表明,在黑色素瘤细胞中,Mps1蛋白表达依赖于B-RafMEKERK通路,同时Mps1激酶和B-RafWTMEKERK通路之间存在一条自动调节的负反馈回路,并且该回路不依赖于Mps1的激酶活性,而癌基因B-RafV600E表现出对该负反馈回路具有抵抗作用,可能由于该抵抗作用,导致Mps1蛋白表达丧失负反馈调控而增加,影响其在中心体复制、纺锤体检测点激活以及染色体不稳定调控中的功能。