研究背景:超声溶栓(Sonothrombolysis,STL)作为一种治疗血栓的新技术已经有20年以上的研究历史,但仍然没有在临床广泛应用。微泡介导的超声溶栓虽然可以显著提高溶栓效率,但无法进入梗阻性血栓内部,其增强空化的能力受限。本研究采用通过介入导管向血栓内注射微泡和尿激酶的方法(Intraclot microbubbles mediated ultrasound thrombolysis,IMUT)溶栓,能够使微泡和尿激酶同时局限在血栓内部,再通过超声激励微泡空化产生声孔效应,促进尿激酶对血栓的渗透,从而获得更好的溶栓效果。本课题组前期实验已经证实,IMUT溶栓效果显著优于经外周循环液中注射微泡的溶栓方法。而本研究的目的是寻找适合IMUT溶栓的声学参数组合,声压(即峰值负压)和超声占空比是决定微泡空化强度的两个关键因素,故本研究旨在探索声压和占空比对体外血栓溶栓率的影响。研究目的:探索血栓内微泡介导的超声溶栓方法(IMUT)增强的体外超声溶栓实验中,不同声压和不同占空比对IMUT超声溶栓的影响。材料与方法:1.实验仪器:(1)超声声孔仪:发射频率为1MHz的DCT-700型超声声孔仪,脉冲重复频率设定为100Hz,声压范围285k Pa-931k Pa可调,占空比1-10%可调。深圳威尔德医疗电子有限公司生产。(2)小动物超声影像系统:加拿大Visual Sonics公司生产的Vevo2100型超高频小动物超声仪,探头频率20MHz,具备超声造影显像模式。(3)倒置荧光显微镜:德国LEICA公司生产DMIRB倒置荧光显微镜。(4)带侧孔酒精注射针:直径21G×200mm,穿刺针尖带有3个侧孔,日本株式会社八光医疗公司生产。(5)体外模拟循环实验装置:由37℃恒温水槽(底部铺垫厚约2cm的吸声海绵)、自制模拟循环密闭管道系统、精密微量蠕动泵组成。2.主要实验试剂:(1)脂氟显微泡造影剂,新桥医院超声科自制,微泡浓度约(7-8)×109/ml,稀释15倍后抽取0.02ml(约含0.9-1.7×107 MBs)注入血栓样本内部。(2)注射用尿激酶,100000IU/瓶,广东丽珠集团丽珠制药厂生产。溶于0.9%氯化钠注射液(中国大冢制药有限公司)0.5ml稀释混匀后抽取20000IU(0.1ml)备用。3.实验方法:制备血栓:取健康志愿者静脉全血100份,每份1m L全血置于EP管中,在恒温水浴箱内孵育3h后取出,去除血清,用中性磷酸盐缓冲液冲洗三遍。实验一:不同声压对血栓内微泡介导的超声溶栓效果影响的体外实验研究50份新鲜人血血栓,平均分成4个实验组和1个对照组(n=10),均采用酒精针向血栓内注入稀释15倍的微泡液0.02 ml及尿激酶2万单位后,使用超声辐照10分钟,占空比设定为10%,脉冲宽度1ms,实验1-4组的声压分别设定为285 k Pa、512 k Pa、708 k Pa、931 k Pa;对照组予超声假照。实验二:不同占空比对血栓内微泡介导的超声溶栓效果影响的体外实验研究50份健康者体外血栓样本,平均分成4个实验组和1个对照组(n=10),均采用酒精针向血栓内注入稀释15倍的微泡液0.02 ml及尿激酶2万单位后,使用超声辐照10分钟,声压设定为931k Pa,实验1-4组占空比分别设定为1%、2%、5%、10%;对照组不予超声治疗。不同声压组和不同占空比组均使用酒精针在血栓内部注射微泡和尿激酶,用滤纸将血栓吸干后,再用电子天平称量血栓的最初质量(W0)。对各组血栓样本治疗后,将剩余血栓从自制模拟循环管道取出,用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗3遍,滤纸反复多次吸干后,电子天平称取剩余血栓质量(W1),计算并比较各组溶栓率。观察指标(1)溶栓率计算公式:(W0-W1)/W0×100%。(2)使用超高分辨率小动物超声仪(Visual Sonics Vevo2100型),分别于注射微泡和尿激酶前、超声辐照前和辐照后观察注射入血栓内部微泡的分布及变化情况。(3)使用LEICA DMIRB倒置荧光显微镜×100光镜下对HE染色后的正常血栓、尿激酶+微泡组血栓、不同声压治疗组和不同占空比治疗组血栓样本的周边及内部情况进行观察。结果:实验一:各组溶栓率比较,实验4组(931k Pa)的溶栓率(50.9±11.5%)显著高于对照组溶栓率(22.9±10.7%)及实验1组(285k Pa)溶栓率(29.5±7.0%)(P<0.01);而实验3组(708k Pa)的溶栓率(46.2±15.6%)也高于对照组溶栓率(P<0.05)。但是实验2组(512k Pa)、实验3组(708k Pa)、实验4组(931k Pa)之间溶栓率差异无统计学意义(P>0.05)。各组血栓标本HE染色后光镜下观察,假照组可见血栓溶解形成的小缺损,周边细胞疏松带薄而略不均匀;随着声压升高,血栓溶解破坏形成的缺损逐渐变大,血栓周边细胞疏松带由厚薄不均到明显增厚、甚至可见空泡形成。实验二:各组溶栓率比较,实验4组(DC=10%)的溶栓率(52.6±14.6%)、实验3组(DC=5%)的溶栓率(42.0±16.0)、实验2组(DC=2%)的溶栓率(39.5±7.9%)均与假照组有显著差异(22.9±10.7%,P<0.01);实验4组(DC=10%)、实验3组(DC=5%)均高于实验1组(DC=1%)的溶栓率(29.7±10.3%)(P<0.05);实验4组(DC=10%)的溶栓率亦高于实验2组(DC=2%)(P<0.05);实验4组(DC=10%)、实验3组(DC=5%)之间溶栓率差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色后×100光镜下观察各组血栓标本,单纯尿激酶+微泡组其周边纤维蛋白网带厚薄均匀、连续性好,无明显差别;随着占空比升高,血栓周边纤维蛋白网带变细、不规则、失去正常连续性、有空泡形成并逐渐增大。单纯尿激酶+微泡组,可见尿激酶作用后纤维蛋白降解形成的小空洞;随着占空比增加,血栓溶解破坏越来越明显、纤维蛋白降解越来越多,形成的空洞越来越大。结论:血栓内注射微泡和尿激酶方法可以增强超声溶栓,在本研究设定的参数范围内,以声压708k Pa、占空比>2%较为合适。