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目的:构建密码子优化的gp120基因重组腺病毒载体rAden-mgp120,并通过DNA和蛋白水平的检测,证实mgp120蛋白可以在体外高效表达,为新型HIV-Ⅰ预防性疫苗的研发奠定基础。方法:首先利用PCR的方法扩增mgp120基因,将目的基因克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得重组穿梭载体pENTR/D-TOPO-mgp120,转化TOP10感受态E.Coli,卡纳霉素抗性筛选并鉴定;经过重组穿梭载体克隆与腺病毒表达载体pAd-CMV/V5-DEST间的同源重组获得表达载体质粒pAden-mgp120,转化TOP10感受态E.Coli,氨苄抗性筛选并鉴定;重组腺病毒表达载体经PacI酶切线性化后,在脂质体介导下,转染病毒包装细胞HEK293A,获得复制缺陷型重组腺病毒rAden-mgp120,并对病毒进行扩增、纯化及滴度测定;通过Western blot法检测mgp120蛋白在HEK293A细胞中的表达。结果:重组穿梭载体质粒pENTR/D-TOPO-mgp120经PCR鉴定表明目的基因插入正确,经测序显示gp120基因序列与Genbank中基因序列比对一致;重组腺病毒表达载体质粒pAden-mgp120经PCR鉴定表明mgp120正确插入到重组腺病毒基因组中;构建的腺病毒载体转染包装细胞HEK293A,10天后开始出现细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE),典型的CPE表现如下:细胞肿胀、变圆、脱落,呈葡萄串状堆积,经扩增后,测定病毒滴度为6.8×1010pfu/ml;用WESTERN blot检测,结果显示52.8KD的特异性条带而对照细胞对应位置未见特异性条带,证明rAd5-mgp120携带的目的基因mgp120可以在体外有效表达。结论:成功构建了重组腺病毒rAden-mgp120,并检测出mgp120蛋白在HEK293A细胞中的表达,为HIV-Ⅰ预防性疫苗的研发奠定了基础。