论文部分内容阅读
研究背景和目的新生血管的稳定和成熟已成为目前血管新生研究领域的热点问题。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的增殖及其向内皮细胞(endothelial cells, ECs)形成的原始血管网的募集是新生血管稳定和成熟的关键步骤。但对于胚胎血管发育早期影响VSMCs募集、趋化分子机制的研究非常有限,主要原因之一是胚胎发育早期VSMCs的分离纯化非常困难。胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)在体外可以自发地分化成拟胚体(embryoid bodies, EBs)并可以模拟胚胎血管形成的过程,为早期VSMCs谱系形成、分化及成熟等机制的研究提供了一种有价值的体外模型。本实验室成功构建了平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下稳定表达增强型绿色荧光蛋白的ESCs,可不经过免疫组织化学染色,在活细胞状态下直接观察到由ESCs向VSMCs分化。本研究旨在此基础上建立胚胎血管发育早期VSMCs趋化模型,采用已知VSMCs体外趋化剂血小板源性生长因子-BB( platelet derived growth factor-BB, PDGF-BB)作为外源性趋化因子,初步观察PDGF-BB对胚胎血管发育早期VSMCs迁移的影响。VSMCs的发育与分化是一个极其复杂的多基因调控过程。PDGF-BB是一种强有丝分裂原,以往研究多认为其能够使来源于成熟血管的VSMCs的多种分化标志物基因表达下调,但其是否对具有全能分化作用的ESCs向VSMCs的分化具有抑制作用,迄今尚不清楚。本研究拟观察胚胎发育早期VSMCs分化标志物SMα-actin、SM22α、myocardin、SMMHC的表达时相,并采用已知血小板源性生长因子受体抑制剂AG1296作为阻断剂,初步探讨PDGF-BB对胚胎血管发育早期VSMCs分化及其标志物表达时相的影响。方法1.细胞培养小鼠ESCs培养于经丝裂霉素C 10μg/mL处理2 h的饲养层细胞STO(小鼠胚胎成纤维细胞株)上。当ESCs生长至亚融合时进行传代,每天换液以维持其未分化状态。2. ESCs分化及EBs模型的建立ESCs细胞培养至亚融合状态,用0.25%胰酶及0.53 mmol/L乙二胺四乙酸消化后,接种到明胶包被的培养皿中实施选择性筛选,3 h后大部分STO细胞已贴壁。将未贴壁的ESCs稀释后接种于细菌培养皿中,培养液除无白血病抑制因子外与ESCs培养液相同。悬浮培养后5 d或6 d,将EBs接种于0.1%明胶铺被的培养皿中贴壁培养,每天换液。3. Under-agarose模型制备用DMEM配制含1%琼脂糖和1%牛血清白蛋白混合配制的凝胶,取3 ml铺于35 mm细胞培养皿,室温下冷却至凝固。用空心金属吸管模具制作3个直径5 mm、间距2 mm的小孔。在倒置显微镜下小心吸取悬浮培养6 d的1个EBs加到中间小孔中贴壁培养,每天换液。4.慢速显微摄像技术(time-lapse) Under-agarose模型中EBs贴壁第6+20 d时,置5% CO2 , 37℃恒温小室,在配有自动摄像装置(CoolSNAPfx)的倒置相差显微镜(Olympus IX-70)下观察细胞移行,每隔10 min作序列摄影,连续拍摄12 h。迁移速率采用图像分析软件(Image-Pro Plus 5.1)示踪程序实施分析测定。5.免疫细胞化学染色固定的EBs经0.05 mol/L TBS中洗涤后,在含0.25% Triton X-100和0.5 mol/L NH4Cl的TBS中通透20 min。5%牛血清白蛋白室温封闭1 h后,与一抗在4℃孵育过夜。一抗包括SMα-actin、Laminin、myocardin、SMMHC、PECAM-1(CD31)。不加一抗做阴性对照片。二抗为四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)或异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体。6.RT-PCR参照Trizol说明书,提取不同时间点EBs中的RNA。取RNA 1μg进行下述指标半定量PCR:PECAM-1、SM22α、myocardin、SMMHC及GAPDH。7.蛋白质印迹分析参照常规方法,提取不同时间点EBs中的总蛋白,然后行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、抗体结合及显色。一抗分别为SMα-actin、myocardin、SMMHC和β-actin抗体。用ECL试剂盒检测目的蛋白。结果1. ESCs形态特征ESCs在STO饲养层上呈未分化状态,形成致密的细胞集落,集落边缘光滑,内部无清晰细胞边界。2. EBs各发育阶段的形态结构EBs经悬浮培养后迅速分化,1 d～2 d后可形成典型的简单EBs(simple embryoid bodies, SEBs),随培养时间延长, SEBs进一步分化形成成熟囊性EBs(cystic embryoid bodies, CEBs),CEBs具有类似早期胚胎的原始内胚层、基底膜、柱状原始外胚层及囊腔等结构。3. Under-agarose模型中EBs分化特征在under-agarose凝胶中,拟胚体在无外源性生长因子存在的条件下可自发向心肌细胞、ECs和VSMCs分化,说明under-agarose凝胶中的EBs具有较完全的分化能力。4. VSMCs及ECs特异性标志物的表达时相胚胎血管发育早期SMα-actin、myocardin、SM22α、SMMHC分别在EBs第0(ESCs)、8、11、13 d开始有表达,表达高峰分别在第10、20、25、25 d左右。CD31在未分化的ESCs即有表达,随后呈先下调再上调的变化特点,于EBs第14 d形成条索状或管腔样结构,表达高峰在第8 d左右。5.外源性PDGF-BB对VSMCs趋化的影响拟胚体贴壁分化20 d时,对照组及4种浓度PDGF-BB(5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml)组VSMCs的平均迁移速率分别为(94.07±23.80)μm/h、(118.08±31.63)μm/h、(173.53±24.58)μm/h、(380.74±39.56)μm/h和(335.62±32.16)μm/h,峰值浓度为20 ng/ml。经浓度>10 ng/ml PDGF-BB处理后,VSMCs向PDGF-BB孔方向移行,对照组、低浓度PDGF-BB组VSMCs呈不规则性迁移。6.外源性AG1296对VSMCs分化的影响AG1296三种浓度(0μmol/L、10μmol/L、50μmol/L)处理后SMα-actin、myocardin、SM22α、SMMHC蛋白表达及myocardin、SM22α、SMMHC mRNA表达均无明显差异。结论1. Under-agarose模型能够模拟胚胎血管发育早期全过程,可用于研究不同生长因子对VSMCs趋化的影响。外源性PDGF-BB能定向诱导胚胎血管发育早期VSMCs迁移,其定向趋化作用在一定浓度范围内呈量效关系。2. EBs发育过程中存在着自发的VSMCs分化,SMα-actin表达最早,依次为myocardin、SM22α、SMMHC;EBs中VSMCs的表达比ECs表达相对延迟;PDGF-BB对EBs分化早期VSMCs标志物表达的调控可能不是必要的。