遗传学中,正反交的结果是判断遗传方式的重要依据。纯种的大白猪与二花脸猪在生长发育、胴体性能、肌肉品质等方面有着显著的差异,通过研究大白猪与二花脸猪正反交F1代的这些重要经济性状的差异,可以探索这些重要经济性状可能的遗传方式。迄今为止,已在人类、小鼠和大鼠等哺乳动物中发现了好几百个MicroRNA(miRNA)。虽然已有多个研究小组试图鉴定更多的猪的miRNA,但目前大多数的猪miRNA还是未知的。miRNA对基因调控网络的复杂性(一个miRNA可以调控多个基因,一个基因也可以受多个miRNA的调控)决定了目前对猪miRNA调控的研究如同“盲人摸象”。因此,对新的猪miRNA的鉴定与表达研究具有重要意义。本论文对大白猪和二花脸猪正反交F1代胴体性能、肉质性能、肌肉中脂肪酸和氨基酸含量的差异,大白猪和二花脸猪正反交F1代的生长发育差异进行了测定与分析,还对猪miRNA及其靶基因的生物信息学预测,猪骨骼肌中miRNA的表达谱,猪骨骼肌miRNA前体克隆测序方法,猪骨骼肌中新发现的miR-1826的荧光定量PCR验证等内容进行了研究。这些研究不仅使本实验室首次建立了miRNA的生物信息学预测、miRNA的靶基因计算、miRNA的克隆测序和miRNA的定量PCR检测的方法,也得到了一些有意义的结果。一、大白猪和二花脸猪正反交F1代胴体性能、肉质性能、肌肉中脂肪酸和氨基酸含量的差异本研究对52头180日龄大白猪和二花脸猪正反交F1代的胴体性能、肉质性状、肌肉中脂肪酸和氨基酸含量的差异进行了分析。结果表明,大白猪和二花脸猪正反交F1代宰前活重、屠宰率、第一肋和最后腰椎背膘厚、皮厚、胴体长、脂肪率、骨率、皮率、肉色、pH1、失水力、嫩度和肌纤维直径差异不显著(P>0.05)。但是,正反交F1代公猪的6-7肋和最后肋骨膘厚、眼肌面积、后腿比例、后腿瘦肉率、胴体瘦肉率和肌内脂肪含量差异显著(P<0.05)。大白公猪×二花脸母猪(LE)的杂交公猪与二花脸公猪×大白母猪(EL)的杂交公猪相比,6-7肋和最后腰椎处背膘厚减小5.7～6.0mm,眼肌面积增大4.69cm2,后腿比例增加1.71%,后腿瘦肉率增加4.21%,胴体瘦肉率增加2.82%,肌内脂肪含量增加2.56%。所有正反交F1代母猪间的胴体和肉质性状均未检测到显著差异。腿肌中的各种脂肪酸和氨基酸的含量也没有差异。但是在背最长肌中,LE杂种公猪与EL杂种公猪相比,其肉豆蔻酸(14：0；P=0.039)、棕榈酸(16：0；P=0.024)、油酸(18：1；P=0.022)的含量高,而亚油酸(18：2；P=0.013)和二十碳五烯酸(20：5；P=0.000)的含量低。LE杂种公猪的背最长肌中的饱和脂肪酸(SFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)比EL杂种公猪的高(P<0.05)。另一方面,EL杂种公猪的背最长肌中的不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸(PUFA)比杂种公猪的高(P<0.05)。总之,正反交F1代猪的6-7肋和最后肋骨膘厚、眼肌面积、后腿比例、后腿瘦肉率、胴体瘦肉率、肌内脂肪含量和背最长肌中的脂肪酸组成仅在公猪间差异显著。二、大白猪和二花脸猪正反交F1代的生长发育差异本研究通过测定大白猪和二花脸猪正反交F1代50胎龄、70胎龄、90胎龄、1日龄、20日龄、70日龄、120日龄和180日龄的各项体尺指标、组织器官重量等生长发育指标的差异,试图寻找这些生长发育性状的遗传规律。结果表明,在90胎龄和20日龄时,大白猪作母本的后代的生长发育较快,体重较大,内脏器官的重量也占有一定的优势,这种优势在后代母猪中表现比公猪或阉公猪之间更明显。但是,到了180日龄,大白猪和二花脸猪正反交F1代仅有眼肌面积上有一定的差异(P<0.05),其他各项生长发育指标均无显著差异(P>0.05)。总之,大白猪作母本的后代表现出了一定的母体效应,母体效应的存在使得大白猪对其后代生产性能的影响高于其直接的加性遗传效应的贡献,在胚胎中期和生后生长期的前期都表现出了一定的优势,但到了生后生长期的后期,如120日龄到180日龄,大白猪和二花脸猪正反交F1代的体重差异不显著,这说明母体效应在后期有所减弱。三、猪MicroRNA及其靶基因的生物信息学预测MicroRNA是一类新发现的长约22nt的非编码小RNA,它们能通过降解靶mRNA或抑制mRNA的转录在多种生物学过程中起到重要作用。本文通过猪的EST序列进行同源搜索新的猪miRNA,即用已知的人和小鼠的miRNA在猪的EST序列中进行同源搜索。通过一系列的筛选后,共预测到了65个新的猪miRNA。用这些新预测的猪miRNA,我们又进一步在NCBI上下载的猪mRNA序列进行了新预测猪miRNA的靶基因预测。这65个新的猪miRNA以及它们潜在的靶有助于我们更好地了解猪miRNA对猪的生长发育的调控作用。本研究也说明,EST同源搜索分析对于miRNA及其靶基因预测是一个较为有效的方法。四、大白猪×二花脸猪骨骼肌中MicroRNA的表达谱为了研究猪骨骼肌中miRNA的作用,本研究检测了大白公猪×二花脸母猪的杂种猪在90胎龄和120日龄时的背最长肌样品中miRNA的表达谱。首先,我们用已知的人和小鼠的miRNA序列在猪的EST序列中进行Blast,经过一系列的筛选后得到了98个新的候选猪miRNA。随后,用这些候选猪miRNA和73个已知的猪的miRNA来做猪的miRNA芯片分析。结果,16个新鉴定的猪miRNA和31个以前已知的猪miRNA被检测在猪的骨骼肌中有表达。在90胎龄时,1niR-1826、miR-26a、miR-199b和let-7表达量最高,而在120日龄时miR-1a、miR-133a、miR-26a和miR-1826表达量最高。从NCBI上下载猪的mRNA序列,用(?)RNAhybrid软件计算了这47个从miRNA芯片中检测到的猪miRNA在猪骨骼肌的mRNA中潜在的靶位点。总之,本研究预测并验证了16个新的miRNA基因,得到了18个miRNA家族潜在的44个靶位点,检测了不同发育时期猪骨骼肌中miRNA的表达谱。这些研究结果为进一步研究猪miRNA的转录后调控提供了有价值的参考。五、大白猪×二花脸猪骨骼肌MicroRNA前体克隆测序方法初探通过构建内源性小RNA的cDNA文库进行克隆测序的方法让大规模的miRNA鉴定成为可能,但这种方法常受其他非miRNA的小RNA序列干扰,导致克隆测序效率较低。本研究探索利用miRNA的特性来提高小RNA的cDNA文库克隆测效率,试图将具有发夹结构的小RNA的cDNA分离出来再做克隆测序。本研究成功地对猪骨骼肌小RNA加上3’和5’接头,PCR扩增后又成功地将其分离为单链cDNA,利用单链cDNA的不同二级结构特性将小RNA的cDNA单链分离开来,并对不同二级结构的cDNA进行了克隆测序。克隆测序结果表明这种方法可以分离出不同二级结构的小RNA,A区和B区的单链克隆测序结果中发夹结构序列的比例有显著差异(P<0.05),同时还检测到了5个新的候选猪miRNA基因序列。如果采用更为精确的单链分离技术将会得到更好的实验结果。六、大白猪×二花脸猪正反交F1代骨骼肌中猪miR-1和miR-1826的定量PCR检测本研究利用小RNA加ploy A尾的方法,实现了一次反转录的样本可以做多个miRNA的荧光定量PCR分析,并对猪骨骼肌中新发现的猪miR-1826作了荧光定量PCR验证。具体方法是先将猪骨骼肌中小RNA提取出来,然后利polyA酶在小RNA后加上约20个碱基A,再利用3’端含有20个碱基T的引物来反转录,最后用miRNA特异的上游引物和位于反转录引物中的下游引物来做PCR。这种方法能实现一次反转录后的cDNA样可以做多个miRNA的荧光定量PCR分析。本研究采用5S rRNA作参照,同时对猪骨骼肌中大量表达的miR-1和miR-1826(本论文中新发现的miRNA)两个猪miRNA进行实时荧光定量PCR分析。结果表明,miR-1和miR-1826的相对表达量在大白猪和二花脸猪正反交F1代猪间没有显著差异(P>0.05),但miR-1在90胎龄时表达量较180日龄时低(P<0.05),miR-1826在90胎龄时表达量较180日龄时高(P<0.05)实验结果用实时荧光定量PCR的方法验证了新发现的猪miR-1826在猪骨骼肌中有表达。